Compartir senyals detectant el quòrum i el paper de les comunitats interespecífiques en una malaltia bacteriana de les plantes

Assignatures

  • patogènesi bacteriana
  • fisiologia bacteriana
  • , signe de cèl·lules
  • , ecologia microbiana

abstracte

Els bacteris patògens interactuen no només amb l’organisme amfitrió, però També és probable que amb la flora microbiana resident. En la malaltia dels nodes d’oliva (Olea Europaea), l’agent implicat és el bacteri PV Savastanoi Pseudomonas. Savastanoi (PSV). Dues espècies bacterianes, és a dir, els aglomerans de pantoea i l’erwinia toletana, que no són patògens i que són epífits i endòfits de l’olivera, han estat molt associats amb el node de l’olivera. Hem identificat els senyals químics produïts per les soques de les tres espècies aïllades del node d’oliva i han descobert que pertanyien a la família dels senyals QS de la lactona N -ayl-Homoseerine. Els gens de la família Luxi / R són responsables de la producció i la resposta a aquests senyals en les tres espècies bacterianes s’han identificat i caracteritzat. La mutagènesi per inactivació genòmica i experiències sobre les plantes ha demostrat que la virulència de PSV depèn críticament de la QS; No obstant això, la manca de producció de senyals es pot completar per E. Toletana o P. agglomerans de tipus salvatge. També sembla que la malaltia causada per PSV es veu agreujada per la presència de les altres dues espècies bacterianes. En aquest article, discutim el paper potencial del sistema de control de qualitat en l’establiment d’un consorci estable que condueix a una malaltia bacteriana poli-bacteriana.

Introducció

Les malalties bacterianes resulten de la capacitat dels patògens Colonitzar i regular l’expressió dels gens en resposta a l’entorn amfitrió. Com a resultat, la majoria dels estudis fins ara s’han centrat en les interaccions moleculars entre l’amfitrió i els bacteris. Hi ha interaccions entre el patogen i altres bacteris que ocupen el mateix nínxol (“residents”)? Per exemple, Sibley et al. (2008) Recentment s’han demostrat que hi havia interaccions bacterianes interespecífiques entre els pseudomonas Aeruginosa, patogen humà i residents bacterians indígenes no patògens presents a l’amfitrió (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Amb aquest treball, tenim la intenció d’iniciar un estudi sistemàtic del paper de la senyalització interespecífica en la patogènia bacteriana de les plantes utilitzant com a model la malaltia del node d’oliva causat pel patogen bacterià Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).

p. Savastanoi està estretament relacionat amb Pseudomonas Syringae, un fitopatogen capaç de provocar molts símptomes en diferents plantes (Hirano i Upper, 2000, Hofte i el seu, 2006). En els darrers anys, la comprensió dels mecanismes de virulència de P. Syringae en plantes herbàcies ha augmentat considerablement i diverses soques també s’han seqüenciat (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). D’altra banda, el progrés en la comprensió de P. Savastanoi patogenicitat a les plantes llenyoses eren molt lents. Les soques de P. Savastanoi poden infectar diverses espècies d’amfitrió llenyoses, com ara oliveres, cendres i oleandres, sovint provocant un creixement excessiu de teixits infectats, causant nodes, possibilitats i creixement similars a les berrugues (Hirano i superior., 2000, Kennelly et al., 1997). 2007). Es distingeixen diferents patovars en aquesta espècie, inclòs el PV. Savastanoi, Pv. Fraxini i PV. Nerii causant nodes i gales als membres de la família d’Oléaceae i Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian i Mansfield, 1993).

El PSV és l’agent responsable de la malaltia del node d’oliva A l’Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian i Mansfield, 1993, Hirano i Superior, 2000). Sorprenentment, s’han dut a terme molt pocs estudis moleculars sobre els determinants de la viulència del PSV fins ara. Aquests estudis inicials han determinat que un sistema de secreció de tipus III i els fitohormones, àcid indol-3-acètic (IAA) i citocinines participen en el desenvolupament del node. (Suico et al., 1985, Glass i Kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodríguez-Moreno et al., 2008).

Curiosament, a més de la PSV, dues altres espècies bacterianes S’han associat molt sovint amb el node de l’oliva, és a dir, els aglomerans de Pantoea (Gavini et al., 1989, Fernandes i Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) i Erwinia Toletana. (Rojas et al., 2004).Fins ara, es coneixen poques coses sobre els possibles efectes sinèrgics i comunitaris d’aquests enterobacterias sobre el desenvolupament de nodes. P. agglomerans està molt estès en molts hàbitats naturals i agrícoles; En particular, està associat a moltes plantes com a epífits i endòfits (Lindow i Brandl, 2003). Es pot frenar el creixement del PSV en oliveres probablement per la producció d’antibiòtics, o en alguns casos també augmentar la mida dels nodes (Marchi et al., 2006). La seva freqüent presència i aïllament del mateix entorn, on conviuen com a residents en endòfits comuns dels nodes de l’oliva, suggereixen que es podrien produir interaccions, la formació de comunitats i sinergies. La comunitat bacteriana del node d’oliva és, per tant, un nínxol especial per estudiar el paper de la comunicació interespecífica i la interacció de la comunitat entre el patogen i el bacteri resident en el desenvolupament de la malaltia.

una cèl·lula cel·lular El mecanisme de senyalització, conegut per tenir un paper important en la virulència de bacteris fitopatògens, és el sistema de comunicació intercel·lular de detecció de quòrum (QS) (von Bodman et al., 2003). QS regula l’expressió dels gens en resposta a la densitat cel·lular a través de la producció i detecció de molècules de senyal (per a revistes, vegeu Basser Referències (2002) i Fuqua i Greenberg (2002)). En els bacteris negatius grams, les molècules de senyal més habituals són lactones d’homoseerines N-ACIL (AHL), que són produïdes per una làctil de lactona sintosa en la majoria dels casos a la família de la proteïna de Luxi. Un regulador transcripcional / transcripció pertanyent a la família Luxr forma un complex amb els AHL relacionats amb les concentracions de llindar (“quòrum”) que afecten així la transcripció dels gens de destinació (Fuqua et al., 2001). Els bacteris de la natura creixen principalment en forma de consorcis poli-microbians, que probablement impliquen la senyalització interespecífica per l’acció de les molècules de senyal difusibles (Ryan i Dow, 2008, Duan et al., 2009). La comprensió de la senyalització contínua de les comunitats poli-bacterianes serà un repte per als estudis futurs, ja que la majoria de les enquestes QS s’han centrat fins ara en les configuracions de monocultura.

El paper de AHL en senyalització interespecífica i la formació de comunitats no és clara I, almenys, en la nostra opinió, no ha estat prou estudiat. Aquest treball se suposa que constitueix l’inici d’un estudi sistemàtic d’aquesta pregunta utilitzant la comunitat de nodes d’oliva entre PSV, P. Aglomerans i E. Toletana com a sistema de model. Les tres espècies produeixen senyals AHL i participen en la senyalització inter-espècie? Fins ara, AHL QS es considera específic de cada espècie / soca, però no està clar si AHL QS té un paper important a jugar en nínxols que impliquen una cooperació estable entre diferents membres bacterians. Els resultats van mostrar que les tres espècies tenen sistemes AHL QS que produeixen AHL similar i en dos casos, produint el mateix AHL. AHL QS s’ha mostrat aquí per primera vegada tan essencial per a la patogenicitat del PSV, perquè la virulència dels mutants AHL QS-Knockout es redueix considerablement. Els co-inoculants en parelles de l’olivera amb residents de tipus salvatge i mutants PSV AHL Synthase restauren la virulència completa del PSV. Això demostra que les diferents espècies poden formar consorcis microbians estables en què AHL QS juga un paper important. En els estudis de co-inoculació de Planta també s’han demostrat que es produeixen sinergies entre les diferents espècies bacterianes, que indiquen que els nodes de l’olivera poden ser causats per una malaltia poli-bacteriana.

soques bacterianes, plasmids i fons

soques PSV, P. agglomerans i e. toletana i plasmids utilitzats en aquest estudi es llisten a la taula 1. Les soques bacterianes es van cultivar a 28 ° C en un entorn mínim M9 addició de glucosa (Sambrook et al., 1989), al King’s B Medi (King et al., 1954) o a Luria – Bertani. Es van utilitzar sis biosensors bacterians AHL per a la detecció d’AHL: Vioaceum Chromobacterium CVO26 Strain (McClean et al., 1997), Agrobacterium Tumefaciens NTL4 / Pzlr4 (Shaw et al., 1997), Escherichia Coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001)., Pseudomonas Putida F117 / Pasc8 i P. Putida F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). Les soques de detector de cromobacterium, Agrobacterium i pseudomonas es van cultivar a 30 ° C com es recomana, mentre que les soques de detectors E. coli es van cultivar a 37 ° C.S’han afegit antibiòtics a les següents concentracions finals segons sigui necessari: Ampicillin, 100 μg ml -1; Estreptomicina, 100 μg ml -1; Tetracicline, 15 μg ml -1 (E. coli) o 40 μg ml -1 (pseudomonas); Gentamicina, 10 μg ml -1 (E. coli), 30 μg ml -1 (Agrobacterium) i 40 μg ml -1 (pseudomonas); Kanamicina, 50 μg ml -1 (E. coli i C. vioaceum) o 100 μg ml -1 (pseudomonas, pantoea i erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ml -1.

Taula de mida completa

Tècniques d’ADN recombinant

Tècniques de DNA recombinants, incloent la digestió a les ajudes per a enzims de restricció, gel d’agarosa Electroforesi, purificació de fragments d’ADN, Lligat amb T4 Ligasa, farcit final mitjançant la transformació de Klenow Enzyme i E. Coli es van realitzar tal com es descriu a Sambrook et al. (1989). Els plasmidis s’han purificat mitjançant les columnes de Jet Star (Genomed, Löhne, Alemanya); L’ADN total de PSV, P. agglomerans i E. Toletana va ser aïllat per Lyse Sarkosyl-Pronase tal com es descriu anteriorment per Millor et al. (1983). Acoblaments triparis entre E. Coli i PSV, P. Aglomerans o E. Toletana s’han realitzat amb la tensió auxiliar E. Coli DH5 (PRK2013). Cerques d’homologia de la seqüència d’ADN es van realitzar mitjançant la base de dades Blast Blast Blast Blast.

Clonació i inactivació de gens QS a P. Savastanoi, P. Aglomerans i E. Toletana

per a PSV dapp- PG 722 i E. Toletana DAPP-PG 735, es van construir dos bancs cosmids utilitzant el Cosmide Plauf3 (Staskawicz et al., 1987) com a vector. Les insercions d’ADN han estat preparades per la digestió parcial per Ecori dels dos DNA genòmica, cadascun ha estat lligat al lloc corresponent a PLAUFR3. A continuació, l’ADN lligat es va embalar en x phage caps utilitzant l’extracte de paquets d’or Gigapack III (Agilent Technologies, Santa Clara, Califòrnia, Estats Units) i les partícules de fags es van transformar en E. coli HB101 segons el recomanat pel proveïdor. Els dos conjunts d’E. Coli HB101, cada alberga una biblioteca cosmida, van ser conjugades massives en el biosensor AHL, C. Violaceum CVO26, com a receptor. Cada conjugació ha donat lloc a un transconant: el cosmide Pth100 de l’E. Toletana Cosmid Bank Dapp-PG 735 i el cosmid PJD100 de la PSV DAPP-PG 722, que va permetre a la tensió CVO26 de produir-se purplis i convertir-se en violeta. El sistema AHL QS d’E. Toletana DAPP-PG 735 s’ha anomenat Etoi / R i s’ha localitzat en un fragment Hindiii de 8 KB que ha estat clonat a PBBBRMCS-1, produint PBBRTOLIR. El sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 ha estat anomenat PSI / R i s’ha localitzat en un fragment de NRU I 5800 PB, que ha estat clonat a PMOSSSIR que produeix PMosBlue.

Diferents mutants genòmics zero S’ha creat al sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722, P. Aglomerans DAPP-PG 734 i E. Toletana DAPP-PG 735 de la següent manera. Per a PSV (I), un fragment intern de 246 PB de PSSI ha estat amplificat des de l’ADN genòmic de la tensió DAPP-PG 728 utilitzant el PSI per a PSI i PSI Rev (Taula 1), i (ii) un fragment de 518 PB de El PSSR s’ha ampliat utilitzant els primers PSSR i PSSR Rev (taula 1). De la mateixa manera, (i) un fragment intern 387 PB de pagí ha estat amplificat des de l’ADN genòmic de la tensió DAPP-PG 734 utilitzant Pagi for i Pagi Rev (Taula 1), dissenyada per a ajuda. Gens publicats de Pagi / R de P. aglomerans. Pv. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009), i (ii) un fragment de PAF de 561 PB ha estat amplificat mitjançant Pagr per a i Pamma Rev (Taula 1). Per a E. Toletana (I), un fragment intern de Toli 350 BP ha estat amplificat des de l’ADN genòmic de la varietat DAPP-PG 735 utilitzant el Toli per i Toli Rev (Taula 1) primers i ((ii) un fragment de 474 PB d’ETOR. Amplificat utilitzant els primers Tolr i Tolr Rev (Taula 1). Tots els productes PCR esmentats anteriorment han estat clonats a Pknock-Km digerits mitjançant Eco RV, generant Pknock-PSI, Pknock-PSSR, Pknock-Pagi, Pknock-Pagr, Pknock-Etoi i Pknock-Etor (Taula 1). Aquests plasmidis es van utilitzar com a sistema d’administració de suïcidi per crear mutants d’inactivació de la tensió PSV DAPP-PG 722, P. agglomerans DAPP-PG 734 i E. Toletana DAPP-PG 735 per recombinació homòloga tal com es descriu anteriorment per Alexeyev (1999). Aquests experiments van permetre la creació dels següents mutants genòmics: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PAG, DAPP-PG 735EO i DAPP-PG 735etor (Taula 1). Tots els mutants han estat verificats per PCR mitjançant primers específics del vector de Pknock-Km i seqüències de l’ADN genòmica aigües amunt i avall dels gens orientats.

Extracció, visualització i quantificació AHL

Les soques de PSV, P.Els aglomerans i E. Toletana van ser provades per primera vegada per a la producció d’AHL mitjançant una anàlisi “T-Trail” en un mitjà sòlid tal com es descriu anteriorment per Piper et al. (1993), utilitzant biosensors AHL (tots els revisats per Steindler i Venturi, 2007). A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4), C. Vioaceum CVO26, E. Coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) i Pseudomonas F117 (PASC8) a Luria – BERTANI GELATED PLATS.

Els ahls han estat Purificat de l’esgotador i separat sobrenedador utilitzant una placa de cromatografia de capa fina (CCM) per a la cromatografia de fase inversa sobre C18, tal com es descriu anteriorment per Shaw et al. (1997). Per a la visualització de CCM, la placa ha estat coberta amb una fina capa de tapa superior AB geled amb A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) en presència de 100 μg ML-1 de X-GAL tal com es descriu anteriorment per Shaw et al. (1997) o amb la Luria Superior Agar – Bertani sembrada amb C. Vicaceum CVO26 (McClean et al., 1997).

Detecció i identificació AHL per cromatografia de fase líquida d’alt rendiment i MS

Els AHL produïts per PSV, E. Toletana i P. agglomerans van ser identificats per LC / MS / Espectrometria de masses (MS) en un experiment de monitorització de múltiples reaccions tal com es descriu anteriorment per Gould et al. (2006). La vigilància es va dur a terme sobre la transició del pare pare a pics dels grups acil i lactona. Els pics s’han comparat amb els estàndards coneguts i també avaluats per l’anàlisi del temps de retenció cromatogràfica. Es va extreure un volum de 200 ml de cultiu acel·lular Supernatants utilitzant el mateix volum d’acetat d’etil, després de l’addició de 0, 1% àcid acètic. Les fases orgàniques estaven separades i assecades sota una campana química. Les mostres extretes per a LC / MS / MS han estat reivíncies en 100 μl d’acetonitril, filtrades en un filtre de 0, 2 μm (Millex LCR4, MilliPore, Billerica, MA, EUA) i diluïts a 300 μl amb aigua que contenia 0, 1 % d’àcid trifluoroacètic. Un volum de 100 μl d’aquesta solució es va injectar en un Gemini C 18 de 2, 0 mm per 150 mm (Phenomenex, Torrance, CA, EUA) que opera a un ritme de 200 μL min -1, l’efluent. Que flueix directament al Espectròmetre de masses. El dissolvent estava format per aigua que conté 0,05% d’àcid trifluoroacètic i dissolvent B inclòs acetonitril que conté 0, 05% d’àcid trifluoroacètic. La columna es va equilibrar en un 20% B per 15 min, la mostra injectada i la columna es va rentar durant 15 minuts addicionals. Una elució de degradat del 20% B a 95% B en 40 minuts es va utilitzar per a la separació d’AHL i la columna es va rentar finalment al 95% B durant 10 minuts abans de reequilibrar.

Proves de motilitat, formació de biofilm , Producció EPS, IAA i Steelofors, Lipasa i Proteash Activitats

Activitats proteolítiques i lipolítiques, es van determinar la natació i la natació com a Huber et al. (2001). El mètode utilitzat per detectar els steiderofors ha estat adaptat des del crom-Azurol-s Agar Agar (Schwyn i Neiland, 1987) Dosing Agar Agar, anteriorment descrit per Caballero-Mellado et al. (2007). La producció de IAA per bacteris es va mesurar utilitzant una dosi de color tal com es descriu anteriorment per Gordon i Weber (1951) i Vasanthakumar i McManus (2004).

L’anàlisi de la producció d’exoploysaccaride (EPS) de P. Els aglomerans i E. Toletana han estat provats en els reis mitjans (b) reis, mentre que el PSV ha estat provat en un mitjà de mannitol sòlid mitjà (MM) (0) (0), 2% d’extracte de llevat, 2% Mannitol, 1, 5 %). % agar). Les soques bacterianes es van cultivar en caixes de Luria – Bertani, ratllades per donar colònies individuals i cultivades a 28 ° C durant 24 hores. Les colònies senzilles es van estriar a KB o MM Agar i cultivades durant 48 hores a les 28 º C. Les colònies que produeixen EPS tenen un aspecte mucoide fluid, mentre que aquells amb un EPS deficient tenen una morfologia no mucoïdal independent. I cremós.

Experiments a Planta

Tots els experiments de Planta es van realitzar a les plantes d’oliva (CV. Frantoio) d’un any. Per preparar els inoculums, els bacteris es cultivaven a Na (agar de nutrients) a 28 ° C durant 48 hores, suspès en aigua desionitzada estèril i ajustada per espectrofotometria a uns 2 x 10 8 CFU ml -1. Per a inoculacions, 10 μl de la suspensió bacteriana que conté 10 CFU ml -1 o aigua (per a les plantes de control) s’han col·locat a les ferides (de 3 a 5 per planta) fetes a l’escorça de la vareta d’oliva amb un bisturí estèril descrit anteriorment per Moretti et al. (2008).Les ferides de plantes inoculars i testimonis han estat protegits amb Parafilm M (American Nacional Can, Chicago, IL, EUA). Les plantes s’han celebrat en caixes de policarbonat transparent per arribar a una alta humitat relativa (90-100%) i es mantenen en una cambra de creixement a 22-24 ° C, amb una il·luminació de 70 μE M -2 S. -1 i un període de llum de 12 h.

En el primer experiment de Planta, es va comprovar si el sistema PSV PSI / R AHL va participar en patogenicitat i virulència. La soca parental PSV DAPP-PG 722 i eliminació de les mutants de PPSI i PPSR s’han inoculat en oliveres i la gravetat de la malaltia ha estat avaluada després de 60 dies mesurant la profunditat de la proliferació de teixits mitjançant la proliferació de teixits utilitzant ‘una escena de Vernier.

En el segon experiment, es va avaluar l’efecte de la co-inoculació d’oliveres amb PSV o els respectius mutants d’AHL QS i E. Toletana o P. agglomerans, així com els seus respectius mutants d’AHL QS, sobre la gravetat de la malaltia i el creixement bacterià de les plantes. després de la inoculació. Per a la co-inoculació, les dues suspensions bacterianes es van barrejar (Relació 1: 1) per obtenir una concentració final de 10 CFU ML -1. La gravetat de la malaltia ha estat registrada per determinar el volum dels nodes, calculats mesurant la longitud, l’amplada i la profunditat (restant el diàmetre de la vareta mesurada per sobre del node de la que es mesura per sota del node) del node a l Ajuda amb un Venier (Moretti et al., 2008). Per a la determinació del creixement bacterià, el teixit corresponent al lloc d’inoculació es va excitar i homogeneïtzar per ruptura mecànica. Les dilucions en sèrie de les suspensions bacterianes resultants es van estendre a través de les plaques i incubades a 27 ± 1 ° C. Els comptes de colònies es van realitzar després de 24 i 48 hores d’incubació. Les colònies de PSV es van distingir fàcilment de les de E. Toletana i P. agglomerans. Les colònies de PSV, el creixement del qual era més lent que el de E. Toletana i P. agglomerans, eren petits, blancs, amb un centre lleugerament elevat i una vora plana transparent plana i corrugada. Les colònies d’E. Toletana eren no pigmentats, circulars, convexos, sòlids sencers, fluids translúcids i molt mucoides (només tipus salvatge). Les colònies de P. agglomerans eren grocs, circulars, lleugerament convexos, amb vora irregular, amb una superfície més o menys arrugada, fluid translúcid i molt mucoide (només tipus salvatge).

en la tercera i quarta experiència, L’efecte de la co-inoculació d’oliva amb PSV i E. Toletana sobre el creixement bacterià es va avaluar 3, 8, 15, 30 i 60 dies després de la inoculació (IPR), tal com es descriu en la segona experiència. Tres plantes replicats per a cada nivell de tractament ((1) PSV, (2) E. Toletana, (3) PSV + E. Toletana) s’han inclòs en cada experiment. Per a cada planta, els inòdroms es van col·locar en tres ferides fetes en tres posicions diferents: basal (uns 20 cm per sobre del sòl), intermedi i apical.

Anàlisis estadístiques

Les dades de El primer i el segon en experiments de Planta van ser sotmesos a una anàlisi de variància i les mitjanes van ser comparades amb la prova Duncan Multi-Beaches, utilitzant el programari DSaastat V. 1.1 (Onofri, 2007).

Les dades del tercer i quart en experiments Planta s’han transformat en logaritmes bàsics (per corregir l’heteroschedasticitat) i s’han utilitzat per establir un model mixt lineal (Garrett et al. , 2004, Onofri, 2010) que descriu la relació entre el nombre de cèl·lules bacterianes i l’arrel quadrada del temps (per a cada tensió / grup) mitjançant funcions polinòmiques del segon ordre. Les anàlisis preliminars van mostrar que l’efecte de la posició d’inoculació (basal, intermedi i apical) no va ser significativa i, per tant, la posició de la planta i la inoculació a la planta es va afegir al model com a efectes aleatoris, per tenir en compte els agrupats dades. L’estimació dels paràmetres es va fer mitjançant la màxima probabilitat, tal com es va implementar en el paquet NLME en l’entorn estadístic R (Venables i Ripley, 2002). Les diferències entre les soques / grups en termes de cinètica de creixement s’han avaluat utilitzant proves de probabilitat.

seqüenciació d’ADN i números d’accés a la seqüència de nucleòtids

Totes les seqüències d’ADN es van dur a terme al Centre de Cribi (Universitat de Pàdua, Itàlia) o Macrogen (www.macrogen.com) i seqüències de nucleòtids es van dipositar a GenBank / EMBL / DDBJ. El Locus Etoi / R QS d’E. Toletana DAPP-PG 735 es diposita sota el número d’accés FN870373, mentre que el PSV PSI / R Locus es diposita sota el número d’accés FN870374.

Producció AHL i sistemes QS de soques P. Savastanoi, P. Aglomerans i E. Toletana

En primer lloc, era interessant determinar si els residents del patogen PSV i de l’oliva produïda AHL QS Signaling molècules. Totes les soques que hem provat (Taula 1) van produir compostos AHL, com ara detectats inicialment per prova de placa en forma de T a C. Vioaceum CV026 i A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) i E. Coli MT102 (PJBA132), biosensors. Per anàlisi CCM, vam atribuir inicialment el tipus d’AHL produït per PSV, P. Aglomerans i E. Toletana (figura 1 i taula 2). Els resultats van mostrar que totes les soques PSV i E. Toletana van produir dues molècules AHL identificades provisionalment com a C6-3-Oxo-HSL i C8-3OXO-HSL (figura 1). P. agglomerans, en canvi, probablement va produir el C4-HSL i C6-HSL. Per confirmar de manera inequívoca els AHL produïts pels tres tints, vam utilitzar la cromatografia líquida d’alt rendiment en la fase inversa C 18 i l’espectrometria de masses, i van poder verificar la producció de 3-Oxo-C6-HSL i 3 -oxo -C8. -Hsl per PSV i E. Toletana i C6-HSL i C4-HSL de P. agglomerans (figura 1 addicional).

Imatge

Producció PSV AHL aïllada de nodes d’oliva i llorer-rosa, E. Toletana i P. agglomerans. (a) CCM analitza els estàndards sintètics ahl utilitzant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensoror com a capa de recuperació. (b) Anàlisi TLC de l’AHL produïda per set soques PSV mitjançant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor com a capa de recuperació. Lans: (1) Strain LMG 2209 t; (2) DAPP-PG 536; (3) DAPP-PG 722; (4) DAPP-PG 723; (5) DAPP-PG 725; (6) DAPP-PG 726; (7) DAPP-PG 728. (C) Anàlisi CCM de l’AHL produïda per dues soques E. Toletana mitjançant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor com a capa de recuperació. Lanes: (8) STEM CFBP 6631 t; (9) DAPP-PG 735. (d) TLC Anàlisi de les normes sintètiques AHL utilitzant C. Vioaceum CV026 Biosensor com a capa de recuperació. (E) Anàlisi CCM d’AHL produïda per P. Aglomerans DAPP-PG 734 (Strip 1) utilitzant el biosensor C. Vioaceum CV026 com a capa de recuperació. AHL, lactona de l’Acil Homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; CCM, cromatografia de capa fina.

Imatge de mida completa

Taula de mida completa

El sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 ha estat identificat i clonat, com Explicat en materials i mètodes, que consisteix en un parell de luxe anomenat PSI i un homòleg Luxr anomenat PSSR (figura 2a). El sistema PSI / R té un alt grau d’homologia (més del 90%) amb el sistema AHLI / R AHL QS de P. Syringae, que respon a la C6-3-OXO-HSL i està involucrada en la virulència (Quinones et al., 2005). De la mateixa manera, hem identificat i clonat el sistema AHL QS d’E. Toletana DAPP-PG 735 (vegeu la secció Material i Mètodes) que consisteix en un disseny designat de Luxi designat ETOR designat (figura 2A). El sistema ETOI / R té una homologia significativa (al voltant del 60%) amb el sistema Erwinia Chrysanthemi PV Expi / R. Zeae (= Dickeya Zeae), que no només és responsable de la producció de C6-3-Oxo-HSL, sinó també de la seva resposta (Nasser et al., 1998, Hussain et al., 2008). Va ser establert per PCR, clonació i seqüenciació que el sistema AHL QS de P. agglomerans de la soca DAPP-PG 734 va ser ortòleg (identitat de més del 95%) relativa al sistema Pagi / R de P. agglomerans PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009).

Imatge

AHL Targetes genètiques i producció de mutants AHL QS-Knockout Olive Isolats Situat a PSV, E. Toletana i P. agglomerans. (A) Mapes genòlics de PPSI / R i Etoi / R Cloned Locis de PSV i E. Toletana, respectivament. En veure el sistema PPSI / R, es demostra que els gens són orthiòlegs del gen PSV de NCPPB 3335. De fet, la regió seqüenciada aquí a la varietat DAPP-PG 722 és ortòleg d’això a la varietat NCPPB 3335. (( B) (a) Anàlisi CCM d’estàndards sintètics AHL mitjançant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor com a capa de recuperació. (b) Anàlisi CCM dels AHL produïts per PSV PSV DAPP-PG 722 i derivats mutants mitjançant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor com a capa de recuperació. PSI – és DAPP-PG 722SII; PSSR – és el DAPP-PG 722SSII. (c) Anàlisi CCM d’AHL produïts per la soca mare E. Toletana DAPP-PG 735 i derivats mutants mitjançant A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor com a capa de recuperació. Toli- és dapp-pg 735toli; Tolr- és DAPP-PG 735TOLR. (d) Anàlisi TLC de les normes sintètiques AHL mitjançant Biosensor CV026 de C.Vioaceum com a capa de recuperació. (e) Anàlisi CCM d’AHL produïda per la soca mare de P. agglomerans dapp-pg 734 i derivats mutants que utilitzen el biosensor C. vioaceum cv026 com a capa de recuperació. Pagi – és DAPP-PG 734PAGI; Pagr – és el DAPP-PG 734PR. AHL, lactona de l’Acil Homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, detecció de quòrum; Savastanoi; CCM, cromatografia de capa prima.

Imatge de mida completa

Els mutants de knvout de PSV, P. agglomerans i e. toletana s’han generat tant en els gens de luxe qs – i Luxr – com descrit en la secció Material i Mètodes. Cap dels mutants de la família luxífera de les tres espècies (DAPP-PG 722SSI, DAPP-PG 734PAGI i DAPP-PG 738etoi; Taula 1) ha produït nivells detectables d’AHL quan s’ha purificat de supernatants gastats (figura 2B). Aquest resultat indica que les tres espècies només tenen un sistema AHL QS; Per a PSV, aquesta conclusió està corroborada pel fet que només una parella de la família Luxi / R està present al seu genoma, que va ser seqüenciat recentment (Rodríguez-Palenzuela et al., 2010). Els mutants de la família Luxr, d’altra banda (DAPP-PG 722PSR, DAPP-PG 734PAR i DAPP-PG 733etor; Taula 1) han produït quantitats d’AHL similar a les produïdes pel tipus salvatge (figura 2B), això Indica en tres sistemes, no hi va haver cap bucle d’amplificació de senyals a través de la regulació del gen de la família Luxi. Aquestes conclusions es basen en l’anàlisi CCM d’extractes sobrats sobrats d’iguals quantitats de cultura a la mateixa fase de creixement. Aquesta és una indicació molt bona, però les mesures realitzades al llarg de la fase de creixement probablement confirmaran aquesta conclusió.

$ config no trobat

qs a la PSV regula la virulència en les plantes

per examinar Si el sistema PSV PSA / R AHL ha estat involucrat en patogenicitat i virulència, PSV PSV DAPP-PG 722 i eliminació de mutants derivats de PPSI i PPSR han estat avaluats, i s’ha avaluat la gravetat de la malaltia. Després de 60 dies. Els resultats demostren clarament que les mutacions de PSI i PSSR van reduir significativament la mida dels nodes i, per tant, la virulència dels mutants (figura 3a). La profunditat dels nodes ha estat reduïda significativament (P = 0, 01) a les barres inoculades amb els mutants de Dapp-PG 722SSI i DAPP-PG 722PSRs, relatiu als inoculats amb el tipus salvatge que mostra reduccions respectives del 80% i 88% (Figura 3b). ) Era important, per tant, es va concloure, al nostre coneixement, que s’havia trobat que, per primera vegada, Ahl Qs havia jugat un paper central en la virulència de PSV.

Imatge

Paper de la QS AHL sobre la formació de nodes d’oliva induïts per PSV. (a) Les tiges d’oliveres d’edat d’un any (CV. Frantoio) es van inocular amb 108 mutants derivats de CFU ML- 1 PSV DAPP-PG 722 (Tipus salvatge: WT), PSSI – i PSSR – i amb plantes de control. S’han observat els símptomes de la malaltia 60 dies després de la inoculació. S’han observat grans nodes elevats en les barres inoculades amb Dapp-PG 722 (tipus salvatge). Els mutants del dèficit en AHL QS PSI – i PSSR només van induir la proliferació de cèl·lules limitades, que es va mantenir limitada a les vores de la ferida. (b) La mida dels nodes es calculava mesurant la profunditat de la proliferació de teixits en cinc plantes per a cada tractament i per a tres nodes per planta. Les diferències estadísticament significatives en els nodes entre el tipus salvatge i els mutants QS van ser determinats per l’anàlisi de variància. Cada valor és la mitjana de cinc repeticions ± desviació estàndard. Les mitjanes no són significativament diferents (P = 0, 01) depenent de la prova múltiple de Duncan. AHL, lactona de l’Acil Homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, detecció de quòrum; Savastanoi.

Imatge de mida completa

PSV ahl sinthasa mutants es pot salvar per la presència d’E. Toletana i en part per P. agglomerans

La presència d’E . Toletana i P. agglomerans en els nodes de l’olivera podrien resultar en la formació d’una comunitat poli-microbiana amb el patogen PSV. Des de E. Toletana i P. agglomerans produeixen AHL i que els mutants PSV de AHL negatiu tenen una virulència molt baixa (vegeu més amunt), això permet una configuració elegant per establir si els senyals d’AHL són compartits i si les comunitats interespecífiques es formen al Node olivier. .

Com E. Toletana produeix estructuralment el mateix AHL com a PSV (vegeu més amunt), es va posar inicialment una co-inoculació a Planta. El mutant PSI AHL Syntase va ser utilitzat per a la co-infecció de les plantes d’oliva amb E. Toletana humit-.Straïda de tipus salvatge PG 735. Aquesta co-inoculació va permetre al mutant PSV ppsi induir la formació de nusos, així com la tensió de tipus salvatge (figura 4). Això probablement s’atribueixi a les dues soques que formen un consorci, on E. Toletana proporciona als AHL a la DAPP-PG 722SSIS, que és capaç de induir l’expressió del gens de destinació de l’AHL QS que resulta en la formació de nodes D ‘oliva. També es van realitzar inoculacions similars en parelles amb el tipus salvatge DAPP-PG 734 de P. agglomerans i, en aquest cas, es va observar una restauració parcial de la formació de nodes (figura 4). Això podria ser degut al fet que P. agglomerans produeix diferents AHL de PSV, al qual el sistema PSI / R probablement hagi respost amb menys eficiència. Importació, parell en inoculacions de planta amb l’E. Toletana o el P. Aglomerans AHL Syntase Syntase, Etoi Gold Pagi, respectivament, no va restaurar la formació de nusos d’oliva. Això clarament índexs que la comunicació interspecies a través de l’intercanvi d’AHL va ser clau en els experiments de co-inoculació anteriors on els mutants de PSV AHL Syntasa van ser co-inoculats de manera independent amb les dues soques de tipus salvatge (Figura 4).

Imatge

Efecte de la co-inoculació de les plantes d’oliva (CV. Frantoio) amb PSV i E. Toletana, P. agglomerans i els respectius mutants ahl qs. PSV: les columnes indiquen efecte sobre la gravetat de la malaltia, expressades com a volum de nus (60 dies després de la inoculació), d’inoculació de la PSV WT (columnes eclosades), de mutants de PSV de QS (columnes blanques representen les columnes de PSI mutant i les columnes negres PSSR Mutants) Només or en combinació amb P. agglomerans (PAG) o I. Toletana (i) i Qs-qs-estranys mutants, Pagi, Pagr, Etoi i Etor. Les plantes de control d’oliva es van inocular amb aigua de distilització (columna gris). Cada valor és la mitjana de cinc replicacions ± sexe seguit per les mateixes lletres no són estadísticament diferents a P = 0,05 (prova de gamma múltiple de Duncan). Ahl, Lactone d’Homoserina Acil; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, Quòrum Sensing.

Imatge de mida completa

El PSV PSSR mutant foud no es pot completar per a l’entrenament de nus d’oliva per E. Toletana i P. agglomerans; La raó més probable és que el mutant PPSR PSV no pot respondre a AHL. Aquests resultats també indiquen que E. Toletana i P. agglomerans Les soques de tipus salvatge no poden causar malalties sols en absència de PSV de tipus salvatge. Importació, en tots els experiments de co-inoculació, les quantitats comparables d’unitats de formació de colònies PSV (CFU) estaven presents al lloc d’inoculació (Figura 5).

ImageImatge

Efecte sobre els nivells de PSV de co-inoculació de les oliveres (CV. Frantoio) amb PSV i E. Toletana, P. Agglomerans i els respectius mutants AHL QS. PSV: les columnes negres indiquen efecte sobre el creixement bacterià de Planta (60 dies després de la inoculació) d’inoculació dels mutants de problemes de la PSV de la mateixa bacteri PSI (columnes blanques) Pssr (columnes blanques) només d’or en combinació amb P . Agglomerans (PAG) o E. Toletana (i) i QS parents-imparells mutants, Pagi, Pagr, ETI i ETR. Cada valor és la mitjana de cinc replicacions ± sexe seguit per les mateixes lletres no són estadísticament diferents a P = 0,05 (prova de gamma múltiple de Duncan). PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi.

Imatge de mida completa

Es va concloure que tant E. Toletana i P. agglomerans poden formar comunitats d’intercanvi estables amb PSV i que la comunicació a través de l’intercanvi de senyals AHL es produïa a Planta.

Paper de la senyalització d’intercacions i consorcis de parells en malalties de nus d’oliva

Com es pot veure els resultats descrits anteriorment, PSV forma comunitats bacterianes amb E. Toletana i P. agglomerans. Per començar a entendre el paper i el resultat de les interaccions possibles entre aquestes tres espècies bacterianes, la virulència de PSV en presència dels altres dos bacteris resident de nus d’oliva van ser provades a Planta. Les oliveres d’un any es van inocular per a cada tensió bacteriana amb 10 μl d’una suspensió bacteriana 10 8 CFU ML -1. Com es mostra a la figura 4, la millora significativa de la virulència PSV en presència d’E. Toletana es va observar com s’indica per un augment considerable (gairebé el 30%) del volum de nus. Això va indicar que E. Toletana contribueix a la patogenicitat de PSV; L’augment de la virulència no va ser a causa dels canvis en els nivells de PSV en la co-inoculació com a la diferència significativa en la càrrega bacteriana (figura 5). La mateixa contribució a la virulència PSV es va observar quan es coenoculant amb l’E. Toletana Ahl Mutant Syntasa; No es pot excloure, però, que els senyals PSV AHL són percebuts per E. Toletana. No s’ha observat cap augment de la virulència, en canvi, quan P.Els aglomerans es van co-inocular amb PSV, i de fet es va observar una lleugera disminució del volum de nusos. Quan es co-inoculant amb la P. Aglomerans AHL Syntase Mutant, però, ha detectat un augment significatiu de la formació de volums de nus, el que significa que QS regula alguns factor (s) en P. agglomerans, que limiten el creixement de PSV i / o l’expressió gènica.

Seguint els resultats evidents sobre la naturalesa poli-bacteriana de la malaltia i en l’intercanvi de senyals AHL entre PSV i E. Toletana, era interessant entendre millor aquesta comunitat bacteriana. L’impacte de la co-inoculació sobre la dinàmica de creixement d’aquests bacteris ha estat determinada en dos experiments diferents. Atès que els resultats d’aquests experiments són similars, només s’han informat dades d’un dels experiments. Per tant, es van dur a terme la co-inoculació i es van determinar les poblacions bacterianes fins a 60 dpi. Quan el PSV DAPP-PG 722 es va inocular sol, es va poder detectar un augment de 10 vegades a la població bacteriana aïllada de 8 dpi de teixit inoculat (al voltant de 10 7 CFU per lloc) (Figura 6a, cercles buits). La població del PSV ha augmentat gradualment a uns 1, 5 × 10 8 CFU per lloc a 60 dpi. Quan es va realitzar una inoculació mixta amb E. Toletana DAPP-PG 735 (Figura 6a, cercle complet), el creixement de la PSV va augmentar significativament (prova de la ràtio de probabilitat amb p < , 0001), mentre que quan E. Toletana es va inocular sol en la mida de les seves poblacions (figura 6b, triangle obert). D’altra banda, el creixement de E. Toletana no es va poder descriure adequadament utilitzant un model polinomi de segon ordre, però no obstant això ha estat estimulat significativament a 30 dpi (l’error de diferència estàndard era de 0, 018) en presència de PSV (Figura 1). 6b, triangle complet), i després de 60 dpi, la mida de la població resultant de la infecció mixta era aproximadament 103 vegades més gran que la obtinguda per inoculacions simples. Aquests resultats són una indicació addicional de la relació íntima i mútua entre PSV i E. Toletana en el node d’oliva, cosa que comporta un agreujament dels símptomes de la malaltia, l’intercanvi de senyals AHL QS i un augment del creixement bacterià. D’ambdues espècies.

Imatge

Les persones dinàmiques poblacions de dapp-pg 722 i E. Toletana DAPP-PG 735 inoculats en tiges d’oliva (CV. Frantoio), sol o en combinació. (a) Creixement PSV només (línia contínua i cercle obert) o en combinació amb E. Toletana (línia de punts i cercle omplert). (b) Creixement de E. Toletana només (línia completa i triangle obert) o en combinació amb PSV (triangle de punts). Els símbols indiquen els comptes observats i les línies indiquen l’ajust del model mixt lineal. L’error típic d’una mitjana era 0, 013.

Imatge de mida completa

Prova de regulació dependent AHL de diversos fenotips a P. Savastanoi, pàg. Aglomerans i E. Toletana

Per establir el possible paper dels sistemes AHL QS en bacteris associats amb els nodes d’oliva, s’han provat diversos fenotips importants per a la regulació de l’AHL QS a les tres espècies. Una llista de tots els fenotips provats per a la regulació AHL QS es resumeix a la taula 2.

Curiosament, vam determinar que P. agglomerans dapp-pg 734 i E. Toletana DAPP-PG 735 també produeixen IAA. Hem provat els tipus de salvatge PSV (DAPP-PG 722), P. agglomerans (DAPP-PG 734), E. Toletana (DAPP-PG 735) i els seus mutants derivats (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SR, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PR, DAPP-PG 735ETO i DAPP-PG 735ET) per a la producció de IAA. De la mateixa manera, vam comprovar si Ahl Qs va participar en la producció d’aceròfors, la producció d’EPS, les activitats proteolítiques i lipolítiques segregades i la motilitat nedant i esclavant. Els resultats d’aquestes investigacions es resumeixen a la taula 2. Sorprenentment, en la majoria de les proves, no es van observar diferències significatives entre les soques de motors i els seus derivats de mutants QS en les condicions provades. La producció de PES ha estat provada qualitativament en una prova de placa a totes les soques silvestres i mutants. Els dos mutants AHL QS de la soca PSV DAPP-PG 722 van mostrar una reducció clara en la producció de PES en relació amb el tipus salvatge (dades no presentades); La producció de PES ha estat restaurada quan el mutant DAPP-PG 722PSI ha estat cultivat en presència de c6-3-oxo o c8-3oxo-HSL exògena (dades no presentades). De la mateixa manera, per a P.Els aglomerans, la inactivació de Pagi va provocar una reducció de la producció de PES; No obstant això, no es va observar cap reducció al mutant PAG en relació amb el tipus salvatge. La producció d’EPS ha estat restaurada quan el mutant DAPP-PG 734PAGI ha estat cultivat en presència de C4-HSL o C6-HSL (dades no presentades). La producció d’EPS també es va reduir en el mutant E. Toletana DAPP-PG 735eto respecte a la del tipus salvatge, i la complementació per addició exògena C6-3-Oxo-HSL o C8-3OXO-HSL restaurada la producció d’EPS . No obstant això, a E. Toletana, la inactivació de l’etch ha augmentat considerablement la producció de PES (dades no presentades).

Discussió

Fins ara, molts estudis han demostrat que el bacteri Les malalties de les plantes van resultar de les interaccions complexes entre el patogen i l’amfitrió. La interacció del patogen amb la flora bacteriana resident és molt menys estudiada i entesa. Els bacteris fitopatògens formen comunitats bacterianes estables amb altres bacteris residents no patògens? Són aquestes xarxes d’associació a l’origen d’una infecció multi-microbiana? La senyalització intercel·lular té un paper per jugar a l’establiment d’aquests consorcis bacterians? Aquestes són les preguntes que comencem a abordar aquí utilitzant la comunitat bacteriana present a la malaltia de node d’oliva. Aquest nínxol és creat pel PSV Patogen; No obstant això, s’han aïllat diverses espècies bacterianes residents no patògenes en aquest entorn, sovint E. Toletana (Rojas et al., 2004) i P. agglomerans (Marchi et al., 2006). Les principals conclusions d’aquest treball són que (i) les tres espècies aïllades del node Olivier produeixen senyals AHL i tenen un sistema AHL QS; En particular, E. Toletana i PSV produeixen els mateixos ahls, (ii) ahl qs a la PSV és essencial per a la virulència perquè els mutants de knock-out són fonamentalment no virulent, (iii) PSV els mutants de l’AHL Syntlasa es poden salvar per e. Toletana i En part per P. agglomerans, destacant l’intercanvi de senyals AHL i la formació de comunitats bacterianes estables, i (IV) E. Toletana forma comunitats de la planta, que actuen com a patogen associat a la sinergia amb el PSV Principal Patogen, co-inoculacions creixent El nombre de bacteris d’ambdues espècies i la gravetat de la malaltia. Tots els mutants bacterians construïts en aquest estudi es van produir durant els esdeveniments de recombinació homòloga i també impliquen insercions plasmides. Per tant, és possible que els nostres experiments realitzats a les plantes sense selecció d’antibiòtics condueixen a un retorn de mutants al tipus salvatge. Com totes les experiències supervisores del nostre estudi no van conduir a un comportament de tipus salvatge, vam concloure que no s’ha produït cap comentari significatiu.

Actualment, els únics determinants moleculars coneguts pel desenvolupament del desenvolupament del node a El PSV és el sistema de secreció de tipus III (Sisto et al., 2004) i Cytokinin Phytohormones i IAA (Suico et al., 1985, Glass i Kosuge, 1988, Rodríguez-Moreno et al., 2008). AHL QS ara es pot afegir a aquesta llista i, segons els nostres coneixements, és el primer sistema regulador vinculat a la viulència del PSV. AHL QS probablement no afectarà la colonització inicial, sinó l’expressió gènica de la virulència associada a elevades densitats de població. Ara seria rellevant determinar si AHL QS participa en la regulació dels tres determinants de la virulència identificats fins ara. El més probable és que AHL QS també reguli molts altres factors de virulència. La seqüenciació recent del genoma PSV ha destacat la presència de molts loci que poden participar en la virulència, incloent cinc sistemes de secreció diferents, efectors de tipus III, compostos fenòlics, quimiotàxis, motilitat, adhesió i gens de toxina (Rodríguez-Palenzuela). et al., 2010). Hem informat que la producció de PES està regulada pel sistema PSV PSC / R; No obstant això, no està clar si l’EPS participa en el procés de la malaltia. La SPE, per exemple, és un factor de virulència i està regulat per AHL QS. Està estretament relacionat amb P. Syringae (Quinones et al., 2005).

La vida dels bacteris dins del node és desconegut en el sentit ampli. Un estudi recent, però, va mostrar que el PSV crea el node formant agregats bacterians, microcolònia i biofilms multicapa (Rodríguez-Moreno et al., 2009, Pérez-Martinez et al., 2010). Sabem poc sobre els efectes de P. agglomerans i E.Toletana sobre el desenvolupament de nodes i la possible formació i estabilitat de consorcis bacterians multiespecífics formats en el node d’oliva. P. agglomerans està molt estès en molts hàbitats naturals i agrícoles; En particular, està associat a moltes plantes com a epífits i endòfits (Lindow i Brandl, 2003). A més, P. agglomerans es pot convertir en un patogen tumorigènic específic de l’amfitrió, un bacteri commovedor associat a moltes plantes, adquirint una illa de patogenicitat transmesa per un plasmidi (Barash i Manulis-Sasson, 2007).

Els AHL produïts per E. Toletana (C6-3-Oxo-HSL i C8-3OXO-HSL són els mateixos que els produïts per PSV. Aquesta és la prova que pot haver-hi senyalització interspecífica a través de l’AHL entre les dues espècies quan ocupen el mateix nínxol. P. agglomerans, en canvi, produeix C4-HSL i C6-HSL; No podem excloure que PSSR i / o ETOR puguin respondre a aquests AHL. De la mateixa manera, no sabem si Pagr també pot respondre a AHL produïda per E. Toletana i PSV. Els nostres estudis que impliquen la co-inoculació binària a Planta mostren que E. Toletana pot salvar PSV mutants psi ahl sinthase per la seva capacitat per induir nodes d’oliva. Atès que els símptomes es posen com a mínim de 25 a 30 dies per créixer, aquest resultat suggereix això. Toletana i PSV són capaces de formar un consorci estable, on les dues espècies se sotmeten a senyalització interespecífica i un compartiment AHL. P. Els aglomerans també poden estalviar, en part, el PSV PPSI mutant; El motiu d’aquest rescat parcial és que els AHL produïts per P. agglomerans no estan ben reconeguts per PSSR, o que el consorci no sigui tan estable com per E. Toletana. És possible que en aquest nínxol, que permeti créixer aquest consorci, per fomentar l’aparició de trechers de trampes bacterians (per exemple, els trampes cecs del senyal, que no responen als senyals AHL), que no contribueixen a La comunitat es pot beneficiar de “factors” o “béns públics” produïts per QS Cooperadors (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Molts altres aïllats bacterians haurien de ser aïllats d’aquest nínxol per determinar aquesta possibilitat.

La capacitat de la PSV per induir la formació de nodes d’oliva es basa en la seva capacitat de regular l’expressió dels gens en resposta. A la Medi ambient de l’amfitrió. També hem començat a preguntar-nos si l’aborígena microflora avorulenta contribueix a la malaltia causada per PSV. La co-inoculació d’E. Toletana amb PSV va resultar en un augment significatiu del volum de nodes d’oliva, que indica que aquest consorci és probablement molt estable i que el PSV es beneficia de la presència d’E. Toletana i potser fins i tot el revers. També és important assenyalar que els estudis de co-inoculació han determinat que E. Toletana i viceversa van estimular significativament el creixement de PSV en el node d’oliva, que indica una estreta associació entre metabolisme, nutrients i senyal. Entre les dues espècies bacterianes. Aquest efecte sinèrgic de E. Toletana amb P. Savastanoi indica clarament un avantatge mutu per a ambdues espècies si creixen i comparteixen el mateix nínxol. La comprensió dels mecanismes de cooperació i comunicació d’aquests dos bacteris il·luminarà el procés de comunicació interespecífica. E. Toletana no és patògena quan s’inocula amb el mutant PSSR de l’AHL QS PSV, però pot servir de patogen accessori quan és consorci amb PSV de tipus salvatge. És possible que l’expressió dels gens de PSV pugui ser influenciat per la presència de residents bacterians o el consorci microbià estabilitza el PSV metabòlicament. La co-inoculació de P. agglomerans amb PSV, en canvi, va resultar en una reducció del volum del node, que va augmentar quan el co-inoculador era el pagí del mutant AHL Syntase. P. Aglomerans és molt probable que produeixi i AHL QS regula el factor, que afecta el PSV, i quan es redueix la producció, P. agglomerans també pot actuar com a patogen accessori.

Hi ha molt. Pocs informes Sobre la contribució / paper de la flora microbiana aborigen resident de l’amfitrió sobre l’acció d’un patogen entrant. És interessant assenyalar que el 1998 s’ha informat que a la rizosfera del blat, hi ha una interparència d’espècies bacterianes que poden compartir molècules d’AHL (Pierson et al., 1998). Dos estudis recents han demostrat que la microflora indígena va tenir una influència en la virulència de P. aeruginosa i que també afecta els perfils d’expressió genètica dels factors associats a la virulència (Duan et al., 2003, Sibley i Al. 2008). .Actualment no està clar si hi ha compartir senyal entre aquests bacteris; S’ha observat que el senyal AI (autoinucer) -2 produeix tant els bacteris gram positius com el gram negatiu podrien ser un senyal interespecífic en aquesta comunitat (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). És interessant assenyalar que Dulla i Lindow (2009) van informar molt recentment que els bacteris epifítics indígenes que produeixen el mateix P. Syringae p. Syringae pot eliminar i interferir amb el procés que causa la malaltia. Aquest treball ha destacat un diàleg transversal a la Phyllosfera de la planta a través de AHL, que va donar lloc a canvis en el comportament (principalment la motilitat, la qual cosa significa menys invasió) i, per tant, la virulència de P. Syringae PV. Syringae. L’ocurrència de la malaltia durant la co-inoculació amb els bacteris epifítics productors d’AHL s’ha reduït en un 50%. Es creu que això es deu a la inducció prematura i prematura de l’AHL QS que afecta l’expressió de factors associats a la virulència. Aquest exemple mostra que la comunicació interspecífica amb la flora bacteriana indígena també pot tenir conseqüències negatives per als agents fitopatògens.

Les dades presentades aquí reforcen encara més la complexitat aparent de les infeccions poli-microbianes; Els nostres resultats indiquen un paper de compartir AHL i la senyalització interespecífica, que proporciona un excel·lent model de treball per aprofundir les interaccions entre comunitats bacterianes. Aquest estudi se centra en les interaccions mediades a AHL en hàbitats naturals; Fins ara, el paper de QS en els bacteris associats a les plantes s’ha estudiat gairebé exclusivament amb soques úniques, malgrat la possibilitat de la senyalització interespecífica que es pot intervenir per l’intercanvi de molècules de senyal AHL a les comunitats microbians barrejades. Les interaccions entre els bacteris de l’entorn natural són complicats per diversos factors, incloent la resposta de l’amfitrió, els paràmetres ambientals i la composició específica de la comunitat. Es suggereix que els estudis futurs hauran de desenvolupar sistemes in vitro per a la comprensió pràctica i detallada de les interaccions d’espècies. Només comencem a desenvolupar eines per estudiar les interaccions microbianes en l’entorn natural.

Els nostres estudis futurs se centraran en l’estabilitat i el paper que juguen per cada espècie en aquest consorci microbià. PSV es pot considerar com el nínxol de creador o el líder d’aquest consorci, mentre que P. Aglomerans i E. Toletana són ocupants o residents de nínxol, que poden convertir-se en patògens auxiliars en presència d’un nínxol de fabricant. Actualment, no està clar si aquests consorcis patògens tenen una raó comuna. Assumim que el Consorci d’Oliva Nodes ha evolucionat a convertir-se en estable i cooperativa perquè l’augment de la piscina genètica i el repertori metabòlic combinat augmenta les possibilitats de supervivència dels participants en diverses condicions (Venturi et al., 2010). Aquest treball suggereix que els processos de comunicació complexos entre espècies podrien ser necessàries per a la formació d’aquests consorcis.

genbank / embl / ddbj

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *