compartiendo señales que demuestran el quórum y la función de las comunidades interespecíficas en una enfermedad bacteriana de las plantas

sujetos

  • Patogenia bacteriana
  • Fisiología bacteriana
  • , muestra de células
  • , ecología microbiana

Resumen

Interactúa no solo con el organismo anfitrionario, sino También lo más probable con la flora microbiana residente. En la enfermedad de los Nodos de Oliva (Olea Europaea), el agente involucrado es la Pseudomonas Savastanoi PV Bacteria. Savastanoi (PSV). Dos especies bacterianas, a saber, Pantoea Agglomerans y Erwinia Toletana, que no son patógenos y que son epifitos y endófitos del olivo, se han asociado muy a menudo con el nodo del olivo. Hemos identificado las señales químicas producidas por las cepas de las tres especies aisladas del nodo de oliva y han descubierto que pertenecían a la familia de las señales QS de la lactona N -AYL-HOMEERINE. Los genes de la familia Luxi / R responsables de la producción y respuesta a estas señales en las tres especies bacterianas se han identificado y caracterizado. La mutagénesis por inactivación genómica y experiencias en las plantas ha demostrado que la virulencia de PSV depende críticamente de la QS; Sin embargo, la falta de producción de señales puede completarse por E. Toletana o P. aglomerans de tipo salvaje. También parece que la enfermedad causada por PSV se ve agravada por la presencia de las otras dos especies bacterianas. En este artículo, discutimos el papel potencial del sistema de control de calidad para establecer un consorcio estable que conduce a una enfermedad poli-bacteriana.

Introducción

Enfermedades bacterianas Resultado de la capacidad de los patógenos Para colonizar y regular la expresión de genes en respuesta al entorno huésped. Como resultado, la mayoría de los estudios hasta la fecha se han centrado en las interacciones moleculares entre el huésped y las bacterias. ¿Hay interacciones entre el patógeno y otras bacterias que ocupan el mismo nicho («residentes»)? Por ejemplo, Sibley et al. (2008) han demostrado recientemente que hubo interacciones bacterianas interespecíficas entre los residentes de patógenos humanos de Pseudomonas Aeruginosa y no patógenos indígenas presentes en el host (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Con este trabajo, tenemos la intención de iniciar un estudio sistemático del papel de la señalización interespecífica en la patogénesis bacteriana de las plantas que utilizan como modelo la enfermedad del nodo de oliva causado por el patógeno bacteriano Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).

p. Savastanoi está estrechamente relacionado con las jeringas Pseudomonas, un fitopatógeno capaz de provocar muchos síntomas en diferentes plantas (Hirano y Superior, 2000, HOFTE y su, 2006). En los últimos años, la comprensión de los mecanismos de virulencia de P. Syingae en las plantas herbáceas ha aumentado considerablemente y también se han secuenciado varias cepas (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). Por otro lado, el progreso en la comprensión de la patogenicidad de P. Savastanoi en las plantas leñosas era muy lenta. Las cepas de P. Savastanoi pueden infectar varias especies de host leñosa, como el olivo, la ceniza y el oleandre, a menudo provocando un crecimiento excesivo de tejidos infectados, causando nodos, posibilidades y crecimiento similares a las verrugas (Hirano y superior., 2000, Kennelly et al., 1997). 2007). Diferentes pativares se distinguen en esta especie, incluyendo el PV. Savastanoi, PV. Fraxini y PV. Nerii causando nodos y gales en miembros de la familia de Oléaceae y Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian y Mansfield, 1993).

El PSV es el agente responsable de la enfermedad del nodo de oliva En el Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian y Mansfield, 1993, Hirano y Superior, 2000). Sorprendentemente, muy pocos estudios moleculares sobre los determinantes de la viñecida de la PSV se han realizado hasta ahora. Estos estudios iniciales han determinado que un sistema de secreción de tipo III y fitohormonas, ácido indol-3-acético (IAA) y citocininas están involucradas en el desarrollo del nodo. (Suico et al., 1985, Glass y Kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodríguez-Moreno et al., 2008).

Curiosamente, además de la PSV, otras dos especies bacterianas Han asociado muy a menudo con el nodo de la aceituna, a saber, Pantoea Agglomerans (Gavini et al., 1989, Fernandes y Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) y Erwinia Toletana. (Rojas et al., 2004).Hasta la fecha, se sabe pocas cosas sobre los posibles efectos sinérgicos y comunitarios de estos enterobacteriaceae en el desarrollo de los nodos. P. aglomerans está muy extendido en muchos hábitats naturales y agrícolas; En particular, se asocia con muchas plantas como epífita y endophyte (Lindow y Brandl, 2003). Puede frenar el crecimiento de PSV en olivos, probablemente, por la producción de antibióticos, o en algunos casos también aumenta el tamaño de los nodos (Marchi et al., 2006). Su presencia frecuente y el aislamiento del mismo entorno, donde coexisten como residentes comunes endofitos de los nodos de la aceituna, sugieren que podrían ocurrir interacciones, la formación de comunidades y sinergias. La comunidad bacteriana del nodo de oliva es, por lo tanto, un nicho especial para estudiar el papel de la comunicación interspecífica y la interacción de la comunidad entre el patógeno y la bacteria residente en el desarrollo de la enfermedad.

una celda celular El mecanismo de señalización, conocido por desempeñar un papel importante en la virulencia de las bacterias fitopatogénicas, es el sistema de comunicación intercelular (QS) de QUORUM Sensing (QS) (VON BODMAN et al., 2003). QS regula la expresión de los genes en respuesta a la densidad celular a través de la producción y la detección de moléculas de señales (para revistas, consulte Referencias de Basser (2002) y Fuqua y Greenberg (2002)). En las bacterias gram negativas, las moléculas de señales más comunes son lactonas de n-acil homoseerina (AHL), que se producen mediante una lactona sintasa acílico en la mayoría de los casos a la familia de proteínas LIXI. Un regulador de transcripción / transcripción que pertenece a la familia LUXR luego forma un complejo con la AHL relacionada con las concentraciones de umbral («quórum»), lo que afecta así a la transcripción de los genes objetivo (Fuqua et al., 2001). Las bacterias en la naturaleza crecen principalmente en forma de consorcios poli-microbianos, lo que más probable es que involucre la señalización interespecífica por la acción de las moléculas de señales difusibles (Ryan y Dow, 2008, Duan et al., 2009). La comprensión de la señalización continua en las comunidades poli-bacterianas será un desafío para futuros estudios, ya que la mayoría de las encuestas de QS se han centrado hasta ahora en las configuraciones de monocultivos.

El papel de las AHL en la señalización interespecífica y la capacitación de las comunidades no está clara Y, al menos en nuestra opinión, no ha sido lo suficientemente estudiado. Se supone que este trabajo constituye el comienzo de un estudio sistemático de esta pregunta utilizando la comunidad de nodos de oliva entre PSV, P. aglomerans y E. Toletana como un sistema modelo. ¿Las tres especies producen señales ahl y participan en la señalización entre especies? Hasta ahora, AHL QS se considera específica para cada especie / cepa, pero no está claro si la AHL QS tiene un papel importante que desempeñar en nichos que involucran una cooperación estable entre diferentes miembros bacterianos. Los resultados mostraron que las tres especies tienen sistemas AHL QS que producen AHL similar y en dos casos, produciendo la misma AHL. AHL QS se ha mostrado aquí por primera vez como esencial para la patogenicidad del PSV, porque la virulencia de los mutantes AHL QS-Kickout se reduce enormemente. Los co-inoculantes en pares del olivo con residentes de tipo salvaje y mutantes de PSV, AHL Synthase restaura la virulencia completa del PSV. Esto demuestra que diferentes especies pueden formar consorcios microbianos estables en los que la AHL QS desempeña un papel importante. En los estudios de coinoculación de Planta también han demostrado que se producen sinergias entre las diferentes especies bacterianas, lo que indica que los nodos del olivo pueden ser causados por una enfermedad poli-bacteriana.

cepas bacterianas, plásmidos y fondos

cepas de PSV, P. Agglomerans y E. toletana y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Las cepas bacterianas se cultivaron a 28 ° C en un entorno mínimo M9 Adición de glucosa (Sambrook et al., 1989), en el Medio B de King (King et al., 1954) o en Luria – Bertani. Se han utilizado seis biosensores bacterianos AHL para la detección de AHL: Vioaceum Chromobacterium CVO26 Strain (McClean et al., 1997), Agrobacterium tumefaciens NTL4 / PZLR4 (Shaw et al., 1997), Escherichia coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001)., Pseudomonas Putida F117 / PASC8 y P. Putida F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). Las cepas de detector de Chromobacterium, Agrobacterium y Pseudomonas se cultivaron a 30 ° C según lo recomendado, mientras que las cepas de detector E. coli se cultivaron a 37ºC.Los antibióticos a las siguientes concentraciones finales se agregaron según sea necesario: ampicilina, 100 μg de ml -1; Estreptomicina, 100 μg ml -1; tetraciclina, 15 μg ml -1 (E. coli) o 40 μg de ml -1 (pseudomonas); gentamicin, 10 μg ml -1 (E. coli), 30 μg ml -1 (Agrobacterium) y 40 μg de ml -1 (pseudomonas); Kanamicina, 50 μg de ml -1 (E. coli y C. Vioaceum) o 100 μg de ml -1 (pseudomonas, panteea y erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ml -1.

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Técnicas de ADN recombinante

técnicas de ADN recombinante, incluida la digestión a la ayuda para las enzimas de restricción, gel de agarosa La electroforesis, la purificación de fragmentos de ADN, la ligadura con T4 Ligase, llenado final utilizando la enzima Klenow y la transformación E. Los coli se realizaron según lo descrito por Sambrook et al. (1989). Los plásmidos se han purificado con columnas de chorro de estrellas (Genomed, Löhne, Alemania); El ADN total de PSV, P. Agglomerans y E. Toletana se aisló por Lyse Sarkosyl-Ponase como se describió anteriormente por Mejor et al. (1983). Los acoplamientos triparentales entre E. coli y PSV, P. aglomeranos o E. Toletana se han realizado utilizando la cepa auxiliar E. coli DH5 (PRK2013). Las búsquedas de homología de secuencia de ADN se realizaron utilizando la base de datos National Biotechnology Center Blast.

clonación e inactivación de genes QS en P. Savastanoi, P. aglomerans y E. Toletana

para PSV DAPP- PG 722 y E. TOLETANA DAPP-PG 735, se construyeron dos bancos cosmidos utilizando el COSMIDE PLAUF3 (Staskawicz et al., 1987) como vector. Las inserciones de ADN se han preparado mediante una digestión parcial por EcoRI de los dos DNA genómicos, luego cada uno ha sido ligado en el sitio correspondiente en PLAUFR3. Luego, el ADN de ligadura se embaló luego en X Fage Heads utilizando el extracto de paquete GIGAPACK III GOLD (Agilent Technologies, Santa Clara, California, Estados Unidos) y las partículas de fagos se transducían en E. coli HB101 según lo recomendado por el proveedor. Los dos conjuntos de E. coli HB101, cada uno refugian una biblioteca de cósmidos, se conjugaron en masa en el Biosensor AHL, C. Violaceum CVO26, como receptor. Cada conjugación ha resultado en un transconejante: el COSMIDE PTH100 del banco de cosmidos E. Toletana DAPP-PG 735 y el COSMID PJD100 del PSV DAPP-PG 722, que permitió la cepa CVO26 de producir Purplish y convertirse en violeta. El sistema AHL QS de E. toletana DAPP-PG 735 se ha llamado ETOI / R y se ha ubicado en un fragmento HindIII de 8 KB que se ha clonado en PBBRMCS-1, produciendo PBBTOLIR. El sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 se ha llamado PSI / R y se ha ubicado en un fragmento NRU I 5800 PB, que se ha clonado en PMOSSSSIR produciendo PMOSBLUE.

Diferentes mutantes cero-genómicos. Se ha creado en el sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans DAPP-PG 734 y E. Toletana DAPP-PG 735 de la siguiente manera. Para PSV (I), se ha ampliado un fragmento interno de 246 PB de PSSI del ADN genómico de la cepa DAPP-PG 728 utilizando la PSI para y PSI REV (Tabla 1), y (ii) un fragmento de 518 PB de PSSR se ha ampliado utilizando los cebadores PSSR y PSSR REV (Tabla 1). De manera similar, (i) se ha ampliado un fragmento interno de 387 PB de PAGI del ADN genómico de la cepa DAPP-PG 734 utilizando PAGI FOR y PAGI REV (Tabla 1), diseñada para ayuda. Genes publicados de PAGI / R de P. aglomeranos. PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009), y (ii) un fragmento de 561 PB de PAGR se ha ampliado utilizando PAGR FOR y PAGR REV (Tabla 1). Para E. toletana (I), se ha ampliado un fragmento interno de 350 pb de TOLI del ADN genómico de la cepa DAPP-PG 735 utilizando los cebadores de Toli para y Toli Rev (Tabla 1) y ((ii) un fragmento de 474 PB de ETOR. Amplificado utilizando los cebadores TOLR para y TOLR REV (Tabla 1). Todos los productos de PCR mencionados anteriormente se han clonado en Pknock-km digerido usando Eco RV, generando Pknock-PSI, Pknock-PSSR, Pknock-Pagi, Pknock-Pagr, Pknock-Etoi y Pknock-Etor (Tabla 1). Estos plásmidos se usaron como un sistema de administración suicida para crear mutantes de inactivación de la cepa PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans DAPP-PG 734 y E. Toletana DAPP-PG 735 por recombinación homóloga como se describe anteriormente por Alexeyev (1999). Estos experimentos permitieron la creación de los siguientes mutantes genómicos: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PAGR, DAPP-PG 735EO y DAPP-PG 735ETOR (Tabla 1). Todos los mutantes han sido verificados por PCR utilizando cebadores específicos del vector Pknock-km y las secuencias genómicas de ADN genómico aguas arriba y corriente abajo de los genes específicos.

Extracción, visualización y cuantificación AHL

Las cepas de PSV, P.Los aglomeranos y E. Toletana se probaron por primera vez para la producción de AHL utilizando un análisis de «TRAIL» T «en un medio sólido, como se describió anteriormente por Piper et al. (1993), utilizando los biosensores AHL (todos revisados por Steindler y Venturi, 2007). A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4), C. Vioaceum CVO26, E. coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) y Pseudomonas F117 (PASC8) en Luria – Placas gelificadas Bertani.

El AHL ha sido Purificado por el sobrenadante agotado y separado utilizando una placa de cromatografía de capa fina (CCM) para la cromatografía de fase inversa en C18, como se describió anteriormente por Shaw et al. (1997). Para la visualización en CCP, la placa se ha cubierto con una capa delgada de la parte superior AB gelificada con A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) en presencia de 100 μg ml- 1 de X-Gal como se describió anteriormente por Shaw et al. (1997) o con el agar superior de Luria, Bertani, sembrado con C. Vicaceum CVO26 (McClean et al., 1997).

Detección e identificación AHL mediante cromatografía de fase líquida de alto rendimiento y MS

Los AHL producidos por PSV, E. Toletana y P. aglomeranos se identificaron mediante lc / ms / espectrometría de masas (MS) en un experimento de monitoreo de múltiples reacciones como se describió anteriormente por Gould et al. (2006). La vigilancia se llevó a cabo en la transición del ion padre a los picos de los grupos de acilo y lactona. Los picos se han comparado con los estándares conocidos y también se evalúan mediante el análisis del tiempo de retención cromatográfica. Se extrajo un volumen de 200 ml de sobrenadantes de cultivo acelular utilizando el mismo volumen de acetato de etilo, después de la adición de 0, ácido acético al 1%. Las fases orgánicas se separaron y se secaron bajo una campana química. Las muestras extraídas para LC / MS / MS se han resuspendido en 100 μl de acetonitrilo, filtradas en un filtro de 0, 2 μm (Millex LCR4, Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) Y se diluyen a 300 μl con agua Milli que contiene 0, 1 % ácido trifluoroacético. Se inyectó un volumen de 100 μl de esta solución en un gemini C 18, 0 mm por 150 mm (fenomenex, Torrance, CA, EE. UU.) Funcionando a una velocidad de 200 μl MIN -1, el efluente que fluye directamente en el espectrómetro de masas. El disolvente estaba formado por agua que contenía un 0,05% de ácido trifluoroacético y solvente B incluido acetonitrilo que contiene 0, ácido trifluoroacético 05%. La columna se equilibró en 20% B durante 15 min, la muestra inyectada y la columna se lavó durante 15 minutos adicionales. La elución de gradiente del 20% B a 95% B en 40 minutos se usó luego para la separación de las AHL y la columna se lavó finalmente al 95% B durante 10 minutos antes de reequilibrar.

Pruebas de motilidad, entrenamiento de biofilm , La producción de EPS, IAA y STEARTHORES, actividades de lipasa y proteasa

Actividades proteolíticas y lipolíticas, enjambres y natación se determinaron como se indicó anteriormente Huber et al. (2001). El método utilizado para detectar los STEARTHORES se ha adaptado del agar de agar de Chromium-Azurol-S (Schwyn y Neiland, 1987) Dosificación de agar Agar, descrito anteriormente por Caballero-Mellado et al. (2007). La producción de IAA por bacterias se midió utilizando una dosis de color como se describe anteriormente por Gordon y Weber (1951) y Vasanthakumar y McManus (2004).

El análisis de la producción de exoploysaccaride (EPS) de P. Agglomerans y E. Toletana se han probado en un Medium Kings (B) Reyes, mientras que el PSV se ha probado en un medio de manitol sólido mínimo (mm) (0) (0), extracto de levadura 2%, 2% de manitol, 1, 5 %). % agar). Las cepas bacterianas se cultivaron en cajas de Luria – Bertani, rayadas para dar colonias individuales y creceron a 28 ° C durante 24 horas. Luego se estriaron colonias simples en KB o mm agar y se cultivaron durante 48 horas a 28 ° C. Las colonias que producen EPS tienen una apariencia de mucoide fluida, mientras que aquellos con EPS deficientes tienen una morfología no mucoidal separada. Y cremoso.

Experimentos en Planta

Todos en los experimentos de Planta se realizaron en plantas de oliva (CV. Frantoio) envejecido un año. Para preparar los inóculos, las bacterias se cultivaron en NA (agar de nutrientes) a 28 ° C durante 48 horas, suspendido en agua desionizada estéril y se ajustó por espectrofotometría a aproximadamente 2 x 10 8 CFU ml -1. Para las inoculaciones, se han colocado 10 μl de la suspensión bacteriana que contiene 10 CFU ML -1 o agua (para plantas de control) (3 a 5 por planta) realizadas en la corteza de la oliva con un escalpelo estéril descrito anteriormente por Moretti et Alabama. (2008).Las heridas de plantas y testigos inoculares han sido protegidos con Parafilm M (American National Can, Chicago, IL, EE. UU.). Las plantas se han mantenido en cajas de policarbonato transparentes para alcanzar una alta humedad relativa (90-100%) y se mantiene en una cámara de crecimiento a 22-24 ° C, con una iluminación de 70 μe M -2. -1 y un período de luz de 12 h.

En el primer experimento en Planta, se verificó si el sistema PSV PSI / R AHL estaba involucrado en la patogenicidad y la virulencia. La cepa parental de PSV DAPP-PG 722 y los mutantes de eliminación de PPSI y PPSR se han inoculado en olivos y la gravedad de la enfermedad se ha evaluado después de 60 días al medir la profundidad de la proliferación de tejidos utilizando la proliferación de tejidos utilizando ‘una escena de Vernier.

En el segundo experimento, se evaluó el efecto de la co-inoculación de olivos con PSV o los mutantes respectivos de AHL QS y E. Toletana o P. aglomeranos, así como sus respectivos mutantes de AHL QS, sobre la severidad de la enfermedad y el crecimiento bacteriano en las plantas. después de la inoculación. Para la coinoculación, las dos suspensiones bacterianas se mezclaron (proporción 1: 1) para obtener una concentración final de 10 CFU ml -1. La gravedad de la enfermedad se ha registrado determinando el volumen de los nodos, calculado midiendo la longitud, la anchura y la profundidad (restando el diámetro de la varilla medida sobre el nodo de la que se mide debajo del nodo) del nodo a l Ayuda con un venier (Moretti et al., 2008). Para la determinación del crecimiento bacteriano, el tejido correspondiente al sitio de inoculación se extirpó y se homogeneizó por ruptura mecánica. Las diluciones en serie de las suspensiones bacterianas resultantes se extendieron sobre las placas NA y se incubaron a 27 ± 1 ° C. Los recuentos de colonias se realizaron después de 24 y 48 horas de incubación. Las colonias de PSV se distinguieron fácilmente de las de E. Toletana y P. aglomerans. Las colonias de PSV, cuyo crecimiento era más lento que el de E. toletana y P. aglomeranos, eran pequeños, blancos, con un centro ligeramente elevado y un borde plano transparente y corrugado. Las colonias de E. toletana no estaban pigmentadas, circulares, convexos, márgenes enteros, fluidos translúcidos y muy mucoides (solo tipo salvaje). Las colonias de P. aglomerans fueron amarillas, circulares, ligeramente convexas, con borde irregular, con una superficie más o menos arrugada, líquido translúcido y muy mucoide (solo tipo salvaje).

en las experiencias tercera y cuarta, El efecto de la coinseculación de olivos con PSV y E. toletana sobre el crecimiento bacteriano se evaluó 3, 8, 15, 30 y 60 días después de la inoculación (IPR), como se describe en la segunda experiencia. Tres plantas replicadas para cada nivel de tratamiento ((1) PSV, (2) E. toletana, (3) PSV + E. Toletana) se han incluido en cada experimento. Para cada planta, los inóculos se colocaron en tres heridas hechas en tres posiciones diferentes: basal (aproximadamente 20 cm por encima del suelo), intermedio y apical.

Análisis estadísticos

Los datos de La primera y la segunda en los experimentos de Planta se sometieron a un análisis de varianza y los promedios se compararon por la prueba de múltiples playas de Duncan, utilizando el software DSAASTAT V. 1.1 (Onofri, 2007).

Los datos de la tercera y cuarta en los experimentos de Planta se han transformado en logaritmos básicos (para corregir la heterohedasticidad) y se han utilizado para establecer un modelo mixto lineal (Garrett et al. , 2004, Onofri, 2010) describiendo la relación entre el número de células bacterianas y la raíz cuadrada del tiempo (para cada cepa / grupo) por medio de funciones polinomiales del segundo orden. Los análisis preliminares mostraron que el efecto de la posición de inoculación (basal, intermedio y apical) no era significativo y, por lo tanto, la posición de la planta y la inoculación en la planta se agregaron al modelo como efectos aleatorios, para tener en cuenta los agrupados. datos. La estimación de los parámetros se realizó mediante la máxima probabilidad, tal como se implementó en el paquete NLME en el entorno estadístico R (Venables y Ripley, 2002). Las diferencias entre las cepas / grupos en términos de cinética de crecimiento se han evaluado utilizando pruebas de probabilidad.

secuenciación de ADN y números de acceso de secuencia de nucleótidos

Todas las secuencias de ADN se llevaron a cabo en el Centro de Cribi (Universidad de Padua, Italia) o macrogen (www.macrogen.com) y las secuencias de nucleótidos se depositaron en GenBank / EMBL / DDBJ. El Locus Etoi / R QS de E. Toletana DAPP-PG 735 se deposita en el número de acceso FN870373, mientras que el locus PSV PSI / R se deposita en el número de acceso FN870374.

AHL Producción y sistemas QS de las cepas P. Savastanoi, P. Agglomerans y E. Toletana

primero, fue interesante determinar si los residentes del patógeno PSV y la aceituna producidos AHL QS Moléculas de señalización. Todas las cepas que probamos (Tabla 1) produjeron compuestos AHL, como detectados inicialmente por la prueba de placa en forma de T en C. Vioaceum CV026 y A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) y E. coli MT102 (PJBA132), biosensores. Por análisis de CCM, inicialmente atribuimos el tipo de AHL producido por PSV, P. aglomerans y E. toletana (Figura 1 y Tabla 2). Los resultados mostraron que todas las cepas de PSV y E. Toletana produjeron dos moléculas de AHL identificadas provisionalmente como C6-3-Oxo-HSL y C8-3OXO-HSL (Figura 1). P. Agglomeranos, por otro lado, lo más probable es que produzca el C4-HSL y C6-HSL. Para confirmar inequívocamente el AHL producido por los tres tintes, utilizamos la cromatografía líquida de alto rendimiento en la fase inversa C 18 y la espectrometría de masas, y pudimos verificar la producción de 3-oxo-C6-HSL y 3 -OXO -C8. -HSL por PSV y E. Toletana, y C6-HSL y C4-HSL por P. Agglomerans (Figura 1 Adicional).

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PSV AHL Producción aislada de los nodos de oliva y laurel-rosa, E. Toletana y P. aglomerans. (a) CCM analiza los estándares sintéticos AHL utilizando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. (b) Análisis TLC de la AHL producida por siete cepas PSV utilizando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. LANES: (1) CUADRADA LMG 2209 T; (2) DAPP-PG 536; (3) DAPP-PG 722; (4) DAPP-PG 723; (5) DAPP-PG 725; (6) DAPP-PG 726; (7) DAPP-PG 728. (C) Análisis de CCM de la AHL producida por dos cepas E. Toletana utilizando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. LANES: (8) STEM CFBP 6631 T; (9) DAPP-PG 735. (D) Análisis TLC de los estándares sintéticos AHL usando C. Vioaceum CV026 biosensor como capa de recuperación. (e) Análisis CCM de AHL producido por P. aglomerans DAPP-PG 734 (Strip 1) utilizando el biosensor C. Vioaceum CV026 como capa de recuperación. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; CCP, cromatografía de capa fina.

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El sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 ha sido identificado y clonado, como Explicado en materiales y métodos, que consiste en un par de luxi llamado PSI y un homólogo LUXR llamado PSSR (Figura 2A). El sistema PSI / R tiene un grado de homología muy alto (más del 90%) con el sistema QS de AHLI / R AHL de P. Syingae, que responde al C6-3-Oxo-HSL y está involucrado en la virulencia (quinones et Al., 2005). De manera similar, hemos identificado y clonado el sistema AHL QS de E. Toletana DAPP-PG 735 (consulte la sección MATERIALES Y MÉTODOS) que consiste en un ETE designado de Luxi designado designado (Figura 2A). El sistema ETOI / R tiene una homología significativa (aproximadamente 60%) con el sistema ERWINIA CHRYSANTHEMI PV Expi / R. Zeae (= Dickeya Zeae), que no solo es responsable de la producción de C6-3-Oxo-HSL, sino también de su respuesta (Nasser et al., 1998, Hussain et al., 2008). Fue establecido por PCR, clonación y secuenciación de que el sistema AHL QS de P. aglomeranos de la cepa DAPP-PG 734 fue ortólogo (identidad de más del 95%) en relación con el sistema PAGI / R de P. Agglomerans PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009).

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AHL Tarjetas y producción genéticas por mutantes AHL QS-Knockout Olive Aislados Ubicado en PSV, E. Toletana y P. aglomerans. (A) Mapas genólicos de PPSI / R y EtoI / R locis clonados de PSV y E. Toletana, respectivamente. Al ver el sistema PPSI / R, se muestra que los genes son ortólogos del gen PSV de NCPPP 3335. De hecho, la región secuenciada aquí en la cepa 722 de DAPP-PG es ortóloga de la que en la cepa NCPPB 3335. (( B) (a) Análisis de CCM de los estándares sintéticos AHL usando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. (b) Análisis de CCM de las AHL producidas por PSV PSV DAPP-PG 722 y derivados mutantes utilizando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. PSI – es DAPP-PG 722SIII; PSSR – es el DAPP-PG 722PSI. (c) Análisis de CCM de AHL producido por la cepa madre E. Toletana DAPP-PG 735 y derivados mutantes utilizando A. Tumefaciens PNTL4 biosensor como capa de recuperación. Toli- es DAPP-PG 735TOLI; TOLR- es DAPP-PG 735TOLR. (d) Análisis TLC de los estándares sintéticos AHL utilizando el Biosensor CV026 de C.Vioaceum como capa de recuperación. (e) Análisis CCM de AHL producido por la cepa madre de P. aglomerans DAPP-PG 734 y derivados mutantes que utilizan el biosensor C. Vioaceum CV026 como capa de recuperación. Pagi – es DAPP-PG 734PAGI; PAGR – es el DAPP-PG 734PAGR. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, detección de quórum; Savastanoi; CCM, cromatografía de capa fina.

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Los mutantes de KNVOUT de PSV, P. aglomerans y E. Toletana se han generado tanto en los genes de QS Luxi, y LUXR, como Descrito en la sección de materiales y métodos. Ninguno de los mutantes de la familia luxíaco de las tres especies (DAPP-PG 722SSI, DAPP-PG 734PAGI y DAPP-PG 738ETOI; La tabla 1) ha producido niveles detectables de AHL cuando se ha purificado de sobrenadantes gastados (Figura 2b). Este resultado indica que las tres especies probablemente tienen un solo sistema AHL QS; Para PSV, esta conclusión se corrobora por el hecho de que solo una pareja de la familia Luxi / R está presente en su genoma, que se secuenció recientemente (Rodríguez-Palenzuela et al., 2010). Los mutantes de la familia LUXR, por otro lado (DAPP-PG 722PSR, DAPP-PG 734PAGR y DAPP-PG 738ETOR; Tabla 1) han producido cantidades de AHL similares a las producidas por el tipo salvaje (Figura 2B), esto que Indica en tres sistemas, no hubo bucle de amplificación de señales a través de la regulación de genes de la familia Luxi. Estas conclusiones se basan en el análisis del CCM de extractos de sobrenadantes agotados de las cantidades iguales de cultivo en la misma fase de crecimiento. Esta es una muy buena indicación, pero las mediciones realizadas a lo largo de la fase de crecimiento probablemente confirmarían esta conclusión más.

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QS en PSV Regula la virulencia en las plantas

para examinar Si el sistema PSV PSA / R AHL ha estado involucrado en la patogenicidad y la virulencia, se han evaluado el PSV PSV DAPP-PG 722 y los mutantes derivados de PPSI y PPSR, y se ha evaluado la gravedad de la enfermedad. Después de 60 días. Los resultados mostraron claramente que las mutaciones en PSI y PSSR redujeron significativamente el tamaño de los nodos y, por lo tanto, la virulencia de los mutantes (Figura 3A). La profundidad de los nodos se ha reducido significativamente (P = 0, 01) en las varillas inoculadas con los mutantes DAPP-PG 722SSSSI y DAPP-PG 722PSRs en relación con aquellos inoculados con el tipo salvaje que muestran reducciones respectivas de aproximadamente 80% y 88% (Figura 3b). ) Fue importante, por lo tanto, se concluyó, a nuestro conocimiento, que se había encontrado de que, por primera vez, la AHL QS había desempeñado un papel central en la virulencia de PSV.

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Papel de la QS AHL en la formación de nodos de oliva inducida por PSV. ( a ) Les tiges d’oliviers âgées d’un an (cv. Frantoio) ont été inoculées avec 108 mutants dérivés de cfu ml- 1 Psv DAPP-PG 722 (type sauvage: WT), pssI – et pssR – et avec contrôle las plantas. Los síntomas de la enfermedad se han observado 60 días después de la inoculación. Se observaron grandes nodos elevados en las varillas inoculadas con DAPP-PG 722 (tipo salvaje). Los mutantes del déficit en la PSI QS PSI, y PSSR de PSSR, solo inducieron, lo que se mantuvo limitado a los bordes de la herida. (b) El tamaño de los nodos se estimó midiendo la profundidad de la proliferación de tejidos en cinco plantas para cada tratamiento y para tres nodos por planta. Las diferencias estadísticamente significativas en los nodos entre los mutantes de tipo salvaje y QS se determinaron mediante análisis de varianza. Cada valor es el promedio de cinco repeticiones ± desviación estándar. Los promedios no son significativamente diferentes (P = 0, 01) dependiendo de la prueba múltiple de Duncan. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, detección de quórum; Savastanoi.

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PSV AHL Los mutantes sintasa se pueden guardar por la presencia de E. toletana y en parte por P. aglommerans

La presencia de e . Toletana y P. aglomeranos en los nodos del olivo podrían resultar en la formación de una comunidad poli-microbiana con el patógeno PSV. Dado que E. Toletana y P. Agglomerans producen AHL y que los mutantes de PSV de AHL negativa tienen una virulencia muy baja (ver arriba), esto permite que una configuración elegante establezca si las señales de la AHL se comparten y, si se forman comunidades interespecíficas en el Nodo Olivier. .

Como E. Toletana produce estructuralmente el mismo AHL que PSV (ver más arriba), inicialmente se estableció una co-inoculación en Planta. La mutante PSI AHL Synthase se usó para la coinfección de plantas de olivo con E. toletana húmedas.Cature de tipo salvaje PG 735. Esta co-inoculación permitió que el mutante PSV PPSI induciera la formación de nudos, así como la cepa de tipo salvaje (Figura 4). Esto puede atribuirse más probable a las dos cepas que forman un consorcio, donde E. toletana proporciona el AHL en el DAPP-PG 722SSSIS, que luego es capaz de inducir la expresión del gen objetivo de la AHL QS que resulta en la formación de nodos D ‘oliva. También se llevaron a cabo inoculaciones similares en parejas con el tipo salvaje DAPP-PG 734 de P. aglomeranos y, en este caso, se observó una restauración parcial de la formación de nodos (Figura 4). Esto podría deberse al hecho de que P. aglomerans produce diferentes AHL de PSV, a la que el sistema PSI / R probablemente ha respondido con menos eficiencia. Importadamente, por parejas en las inoculaciones de Planta con la E. Toletana o el mutante de P. Agglomerans AHL Synthase, EtOI Gold Pagi, responiventamente, no restauró la capacitación de Olive Knot. Esto claramente íntí ÍNDICE que la comunicación interspecies a través del compartimiento de las AHL fue clave en los experimentos de coinoculación anteriores donde los mutantes sintasa de PSV AHL se coinclicaron de forma independiente con las dos cepas de tipo salvaje (Figura 4).

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Efecto de la coinoculación de plantas de olivo (CV. FRANTIOIO) con PSV y E. Toletana, P. aglomeranos y los mutantes de AHL QS respectivos. PSV: Las columnas indican efecto en la gravedad de la enfermedad, expresadas como volumen de nudo (60 días después de la inoculación), de la inoculación de la PSV de WT (columnas incubadas), de mutantes con discapacidades QS de PSV (columnas blancas representan PSI mutantes y columnas negras PSSR Mutantes) solo oro en combinación con P. aglomerans (PAG) o E. Toletana (y) y mutantes QS-RAM, Pagi, Pagr, EtOI y Etores relativos. Las plantas de control de oliva se inocularon con agua distante (columna gris). Cada valor es la media de cinco replicaciones ± el sexo seguido de las mismas letras no son estadísticamente diferentes en P = 0.05 (prueba de rango múltiple de Duncan). AHL, lactona de acilo homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, Sensación de quórum.

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El mutante PSV PSSR COUD no se debe completar para la capacitación de nudos de Olive por E. Toletana y P. aglomerans; La razón más probable es que el mutante PSV PPSR no puede responder a las AHL. Estos resultados también indican que las cepas de tipo salvaje E. Toletana y P. Agglomerans no pueden causar enfermedad sola en ausencia de PSV de tipo salvaje. Importy, en todos los experimentos de coinoculación, se presentaron cantidades comparables de unidades de formación de colonias PSV (CFU) en el sitio de inoculación (Figura 5).

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Efecto en los niveles de PSV de la coinseculación de plantas de oliva (CV. FRANGOIO) con PSV y E. Toletana, P. Los aglomeranos y los respectivos mutantes de P QS. PSV: Las columnas negras indican el efecto sobre el crecimiento bacteriano en Planta (60 días después de la inoculación) de la inoculación de los mutantes con discapacidades QS de la misma bacteria PSI (columnas blancas) PSSR de oro (columnas incubadas) solo en combinación con P . Agglomerans (PAG) o E. Toletana (y) y mutantes QS-PS-RAM, Pagi, Pagr, ETI y ETR. Cada valor es la media de cinco replicaciones ± el sexo seguido de las mismas letras no son estadísticamente diferentes en P = 0.05 (prueba de rango múltiple de Duncan). PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi.

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Se concluyó que tanto E. Toletana como P. Agglomeranos pueden formar comunidades de interspecies estables con PSV y esa comunicación a través de la participación de las señales de AHL se estaba realizando en Planta.

Papel de la señalización de las funciones de interspecies y consorcios por parejas en la enfermedad de Olive Knot

Como evidente a partir de los resultados descritos anteriormente, PSV forma a las comunidades bacterianas con E. Toletana y P. aglomerans. Para comenzar a comprender el papel y el resultado de las interacciones entre estas tres especies bacterianas, la virulencia de PSV en presencia de las otras dos bacterias residentes de Olive KNOT, se probó en Planta. Las plantas de oliva de un año de edad se inocularon para cada tensión bacteriana con 10 μl de una bacteriana que tiene la suspensión 10 8 CFU ML -1. Como se muestra en la Figura 4, la mejora significativa de la virulencia de PSV en presencia de E. toletana se observó como se indica por un aumento considerable (casi el 30%) del volumen de nudos. Esto indicó que E. toletana contribuye a la patogenicidad del PSV; El aumento de la virulencia no se debió a los cambios en los niveles de PSV en la co-inoculación, ya que el más que el más que era una diferencia significativa en la carga bacteriana (Figura 5). Se observó la misma contribución a la virulencia PSV cuando coinculó con la E. Toletana Ahl mutante sintasa; Sin embargo, uno no puede exclusivo, que E. Toletana percibe las señales de PSV AHL. Ningún aumento de la virulencia, por otro lado, se observó cuando P.Los aglomeranos se coinsecularon con PSV, y, de hecho, se observó una ligera disminución del volumen de nudos. Sin embargo, cuando co-inoculación con el p. Sin embargo, se detectó aglomerans AHL Synthase Mutant, tiene un aumento significativo en el entrenamiento de volumen de nudos, lo que significa que la QS regula algunos factores (s) en P. aglomeranos, que limitan el crecimiento de PSV y / o la expresión génica.

Siguiendo los resultados obvios sobre la naturaleza poli-bacteriana de la enfermedad y en el intercambio de señales AHL entre PSV y E. Toletana, fue interesante comprender mejor esta comunidad bacteriana. El impacto de la coinseculación en la dinámica de crecimiento de estas bacterias se ha determinado en dos experimentos distintos. Dado que los resultados de estos experimentos son similares, solo se han reportado datos de uno de los experimentos. Por lo tanto, se llevaron a cabo la coinoculación y las poblaciones bacterianas se determinaron hasta 60 DPI. Cuando se inoculó el PSV DAPP-PG 722 solo, se podría detectar un aumento de 10 veces en la población bacteriana aislada de 8 tejidos inoculados DPI (aproximadamente 10 7 CFU por sitio) (Figura 6A, círculos vacíos). La población PSV ha aumentado gradualmente a aproximadamente 1, 5 × 10 8 CFU por sitio a 60 dpi. Cuando se realizó una inoculación mixta con E. toletana dapp-pg 735 (Figura 6A, círculo completo), el crecimiento de PSV se incrementó significativamente (prueba de la relación de probabilidad con P < 0 , 0001), mientras que cuando E. toletana se inoculó solo en el tamaño de sus poblaciones (Figura 6B, triángulo abierto). Por otro lado, el crecimiento de E. toletana no se pudo describir adecuadamente utilizando un modelo polinomial de segundo orden, pero sin embargo, se ha estimulado significativamente a 30 dpi (el error de diferencia estándar fue de 0, 018) en presencia de PSV (Figura 1). 6B, triángulo completo), y después de 60 dpi, el tamaño de la población resultante de la infección mixta fue aproximadamente 103 veces mayor que la obtenida por inoculaciones simples. Estos resultados son una indicación adicional de la relación íntima y mutua entre PSV y E. toletana en el nodo de oliva, lo que resulta en una agravación de los síntomas de la enfermedad, el intercambio de señales de QS AHL y un aumento en el crecimiento bacteriano. De ambas especies.

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Las poblaciones de personas dinámicas de DAPP-PG 722 y E. Toletana DAPP-PG 735 inoculado en tallos de olivos (CV. Frantoio), solo o en combinación. (a) Crecimiento de PSV solo (línea continua y círculo abierto) o en combinación con E. toletana (línea punteada y círculo lleno). (b) crecimiento de E. toletana solo (línea completa y triángulo abierto) o en combinación con PSV (triángulo punteado y completo). Los símbolos indican las cuentas observadas y las líneas indican el ajuste del modelo mixto lineal. El error típico de un promedio fue 0, 013.

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Prueba de regulación dependiente de AHL de varios fenotipos en P. Savastanoi, p. Agglomerans y E. Toletana

Para establecer el posible papel de los sistemas de QS AHL en bacterias asociadas con los nodos de oliva, se han probado varios fenotipos importantes para la regulación de la QS de la AHL en las tres especies. Una lista de todos los fenotipos probados para el Reglamento AHL QS se resume en la Tabla 2.

Curiosamente, determinamos que P. aglomerans DAPP-PG 734 y E. Toletana DAPP-PG 735 también producen IAA. Probamos los tipos silvestres PSV (DAPP-PG 722), P. aglomerans (DAPP-PG 734), E. Toletana (DAPP-PG 735) y sus mutantes derivados (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SSR, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PAGR, DAPP-PG 735ETO Y DAPP-PG 735ET) PARA LA PRODUCCIÓN DE IAA. De manera similar, nos verificamos si AHL QS estuvo involucrado en la producción de aceros, la producción de EPS, las actividades proteolíticas y lipolíticas secretadas y la motilidad por nadar y enjaminar. Los resultados de estas investigaciones se resumen en la Tabla 2. Sorprendentemente, en la mayoría de las pruebas, no se observaron diferencias significativas entre las cepas de motores y sus derivados de QS mutantes en las condiciones probadas. La producción de PES se ha probado cualitativamente en una prueba de placa en todas las cepas silvestres y mutantes. Los dos mutantes AHL QS de la cepa PSV DAPP-PG 722 mostraron una reducción clara en la producción de PSA en relación con el tipo salvaje (datos no presentados); La producción de PES se ha restaurado cuando el mutante DAPP-PG 722PSI se ha cultivado en presencia de C6-3-OXO o C8-3OXO-HSL exógeno (datos no presentados). Del mismo modo, para P.Agglomeranos, la inactivación de PAGI dio lugar a una reducción en la producción de PES; Sin embargo, no se observó ninguna reducción en el mutante PAGR en relación con el tipo salvaje. La producción de EPS se ha restaurado cuando el mutante DAPP-PG 734PAGI se ha cultivado en presencia de C4-HSL o C6-HSL (datos no presentados). La producción de EPS también se redujo en el mutante E. Toletana DAPP-PG 735ETO con respecto a la del tipo salvaje, y la complementación por adición exógena C6-3-Oxo-HSL o C8-3Oxo-HSL restauró la producción de EPS . Sin embargo, en E. toletana, la inactivación del ETCH ha aumentado considerablemente la producción de PES (datos no presentados).

Discusión

Hasta la fecha, muchos estudios han demostrado que la bacteriana Enfermedades de las plantas resultadas de interacciones complejas entre el patógeno y el huésped. La interacción del patógeno con la flora bacteriana residente es mucho menos estudiada y entendida. ¿Las bacterias fitopatogénicas forman comunidades bacterianas estables con otras bacterias residentes no patógenas? ¿Están estas redes de asociación en el origen de una infección multicontrial? ¿Tiene la señalización intercelular un papel que desempeñar para establecer estos consorcios bacterianos? Estas son las preguntas que comenzamos a abordar aquí utilizando la comunidad bacteriana presente en la enfermedad del nodo de oliva. Este nicho es creado por el patógeno PSV; Sin embargo, varias otras especies bacterianas residentes no patógenas se han aislado en este entorno, la mayoría de las veces E. Toletana (Rojas et al., 2004) y P. aglomerans (Marchi et al., 2006). Las principales conclusiones de este trabajo son que (i) las tres especies aisladas del nodo Olivier producen señales de AHL y tienen un sistema AHL QS; En particular, E. Toletana y PSV producen el mismo AHLS, (ii) AHL QS en PSV es esencial para la virulencia porque los mutantes eliminatorios son fundamentalmente no virulentos, (iii) PSV, los mutantes de la AHL sintasa se pueden salvar por e. Toletana y En parte por P. aglomerans, destacando el intercambio de señales de AHL y la formación de comunidades bacterianas estables, y (iv) E. Toletana forman comunidades en la planta, que actúan como un patógeno asociado en la sinergia con el patógeno principal PSV, aumentando las coinoculaciones. El número de bacterias de ambas especies y la severidad de la enfermedad. Todos los mutantes bacterianos construidos en este estudio se produjeron durante los eventos de recombinación homólogos y también implican inserciones plasmídicas. Por lo tanto, es posible que nuestros experimentos realizados en plantas sin selección de antibióticos conduzcan a un retorno de mutantes al tipo salvaje. Como todas las experiencias de supervisión de nuestro estudio no llevaron a un comportamiento de tipo salvaje, concluimos que no se había realizado comentarios significativos.

Actualmente, los únicos determinantes moleculares conocidos por el desarrollo del desarrollo del nodo en PSV son el sistema de secreción Tipo III (Sisto et al., 2004) y Phitohormones de citoquinina e IAA (Suico et al., 1985, Glass y Kosuge, 1988, Rodríguez-Moreno et al., 2008). AHL QS ahora se puede agregar a esta lista y, a nuestro conocimiento, es el primer sistema regulatorio vinculado a la VIULENCIA DEL PSV. La AHL QS probablemente no afectará la colonización inicial, sino la expresión génica de la virulencia asociada con las altas densidades de población. Ahora sería relevante para determinar si la AHL QS está involucrada en la regulación de los tres determinantes de la virulencia identificada hasta la fecha. Lo más probable es que la AHL QS también regula muchos otros factores de virulencia. La reciente secuenciación del genoma PSV ha destacado la presencia de muchos loci que pueden participar en la virulencia, incluidos cinco sistemas de secreción diferentes, efectores de tipo III, compuestos fenólicos, quimiothaxis, motilidad, adhesión de la adhesión y genes de toxina (Rodríguez-Palenzuela). et al., 2010). Informamos que la producción PES está regulada por el sistema PSV PSC / R; Sin embargo, no está claro si el EPS está involucrado en el proceso de la enfermedad. El SPE, por ejemplo, es un factor de virulencia y está regulado por AHL QS. Está estrechamente relacionado con P. Syingae (Quinones et al., 2005).

La vida útil de las bacterias dentro del nodo es desconocida en el sentido amplio. Sin embargo, un estudio reciente mostró que PSV crea el nodo formando agregados bacterianos, microcolonia y biopelículas multicapa (Rodríguez-Moreno et al., 2009, Pérez-Martínez et al., 2010). Sabemos poco sobre los efectos de P. aglomerans y E.Toletana sobre el desarrollo de nodos y la posible formación y estabilidad de los consorcios bacterianos multiespecíficos formados en el nodo de oliva. P. aglomerans está muy extendido en muchos hábitats naturales y agrícolas; En particular, se asocia con muchas plantas como epífita y endophyte (Lindow y Brandl, 2003). Además, P. aglomerans se puede convertir en un patógeno tumorigénico específico del huésped, una bacteria de comensal y epífita asociada con muchas plantas, al adquirir una isla de patogenicidad transmitida por un plásmido (Barash y Manulis-Sasson, 2007).

Los AHL producidos por E. toletana (C6-3-Oxo-HSL y C8-3OXO-HSL) son los mismos que los producidos por PSV. Esta es una prueba de que puede haber una señalización interespecífica a través de la AHL entre las dos especies cuando ocupan el mismo nicho. P. Agglomeranos, por otro lado, produce C4-HSL y C6-HSL; No podemos excluir que PSSR y / o ETOR puedan responder a estos AHL. De manera similar, no sabemos si PAGR también puede responder a las AHL producidas por E. Toletana y PSV. Nuestros estudios relacionados con la coinseculación binaria en Planta demostraron que E. Toletana puede ahorrar mutantes de PSV PSI AHL sintasa por su capacidad para inducir los nodos de oliva. Dado que los síntomas ponen al menos 25 a 30 días para crecer, este resultado sugiere que. Toletana y PSV son capaces de formar un consorcio estable, donde las dos especies se someten a una señalización específica y compartir una AHL. P. Agglomerans también puede ahorrar, en parte, el mutante PSV PPSI; La razón de este rescate parcial es que el AHL producido por P. aglomeranos no está bien reconocido por PSSR, o que el consorcio no es tan estable como para E. Toletana. Es posible que en este nicho, lo que permita que ese consorcio crezca, fomente la aparición de trechores de trampas bacterianos (por ejemplo, los tramposos ciegos de la señal, que no responden a las señales AHL), que no contribuyen a La comunidad puede beneficiarse de «factores» o «bienes públicos» producidos por cooperadores QS (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Muchos otros aislados bacterianos deben aislarse de este nicho para determinar esta posibilidad.

La capacidad de PSV para inducir la formación de los nodos de oliva se basa en su capacidad para regular la expresión de los genes en respuesta. A la Ambiente del host. También hemos empezado a preguntarnos si la microflora avorulenta aborigen contribuye a la enfermedad causada por PSV. La co-inoculación de E. toletana con PSV dio como resultado un aumento significativo en el volumen de los nodos de oliva, lo que indica que este consorcio es probablemente muy estable y que PSV se beneficie de la presencia de E. toletana y quizás incluso la inversa. También es importante tener en cuenta que los estudios de coinoculación han determinado que E. toletana y viceversa estimuló significativamente el crecimiento de PSV en el nodo de oliva, lo que indica una asociación estrecha entre el metabolismo, los nutrientes y la señal. Entre las dos especies bacterianas. Este efecto sinérgico de E. toletana con P. Savastanoi indica claramente una ventaja mutua para ambas especies si crecen y comparten el mismo nicho. Comprender los mecanismos de cooperación y comunicación de estas dos bacterias iluminará el proceso de comunicación interspecífica. E. Toletana no es patógeno cuando se inocula con el mutante PSSR de PSV PSV de AHL, pero puede servir como un patógeno accesorio cuando es consorcio con PSV de tipo salvaje. Es posible que la expresión de los genes PSV pueda estar influenciada por la presencia de residentes bacterianos o el consorcio microbiano estabiliza el PSV metabólicamente. La coincoculación de P. aglomeranos con PSV, por otro lado, dio lugar a una reducción en el volumen del nodo, que aumentó cuando el co-inoculante fue el Pagi de la AHL mutante sintasa. P. Los aglomeranos tienen más probabilidades de producir y la AHL QS regula el factor, que afecta a la PSV, y cuando se reduce la producción, P. aglomeranos también puede actuar como un patógeno accesorio.

Hay mucho. Pocos informes sobre la contribución / papel del residente de la flora microbiana aborigen del host en la acción de un patógeno entrante. Es interesante observar que en 1998 se ha informado que en la rizosfera de trigo, existe una inter-población de especies bacterianas que posiblemente pueden compartir moléculas de la AHL (Pierson et al., 1998). Dos estudios recientes han demostrado que la microflora indígena influyó en la virulencia de P. aeruginosa y que también afecta los perfiles de expresión genética de los factores asociados con la virulencia (Duan et al., 2003, Sibley y al., 2008). .Actualmente no está claro si hay un intercambio de señales entre estas bacterias; Se ha observado que la señal de AI (autoinucer) -2 produce tanto las bacterias de gram positivas como los gram negativos podrían ser una señal interspecífica en esta comunidad (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Es interesante observar que Dulla y Lindow (2009) informaron muy recientemente que las bacterias epipíticas indígenas producen la misma p. Syringae p. Las jeringas pueden eliminar e interferir con el proceso que causa la enfermedad. Este trabajo ha resaltado un diálogo cruzado en la filoflefa de la planta a través de la AHL, lo que resultó en cambios en el comportamiento (principalmente la motilidad, lo que significa menos invasión) y, por lo tanto, la virulencia de P. syringae PV. Jeringa. La aparición de la enfermedad durante la co-inoculación con bacterias epífitas productoras de AHL se ha reducido en un 50%. Se cree que esto se debe a la inducción prematura y prematura de AHL QS que afecta la expresión de factores asociados con la virulencia. Este ejemplo muestra que la comunicación interespecífica con la flora bacteriana indígena también puede tener consecuencias negativas para los agentes fitopatogénicos.

Los datos presentados aquí refuerzan aún más la complejidad aparente de las infecciones poli-microbianas; Nuestros resultados indican un papel de compartir la señalización AHL e interspecífica, que proporciona un excelente modelo de trabajo para profundizar las interacciones entre las comunidades bacterianas. Este estudio se centra en las interacciones mediadas por la AHL en los hábitats naturales; Hasta ahora, el papel de QS en las bacterias asociadas con las plantas se ha estudiado casi exclusivamente con cepas únicas, a pesar de la posibilidad de la señalización interspecífica que puede estar mediada por el intercambio de moléculas de señales AHL en las comunidades microbianas mixtas. Las interacciones entre el entorno natural Las bacterias se complican mediante una serie de factores, incluida la respuesta de host, los parámetros ambientales y la composición específica de la comunidad. Se sugiere que los estudios futuros deberán desarrollar sistemas in vitro para la comprensión práctica y detallada de las interacciones de las especies. Acabamos de comenzar a desarrollar herramientas para estudiar las interacciones microbianas en el entorno natural.

Nuestros estudios futuros se centrarán en la estabilidad y el papel desempeñado por cada especie en este consorcio microbiano. PSV puede ser considerado como el creador de nichos o el líder de este consorcio, mientras que P. aglomerans y E. Toletana son ocupantes o residentes de nichos, que pueden, sin embargo, que pueden convertirse en patógenos auxiliares en presencia de un nicho de fabricante. En la actualidad, no está claro si estos consorcios patógenos tienen una razón común. Asumimos que el consorcio de los nodos de oliva ha evolucionado para ser estable y cooperativo porque el aumento del grupo genético y el repertorio metabólico combinado aumentan las posibilidades de supervivencia de los participantes en diversas condiciones (Venturi et al., 2010). Este trabajo sugiere que los procesos de comunicación complejos entre las especies podrían ser necesarios para la formación de dichos consorcios.

Genbank / EMBL / DDBJ

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