Sharing sinais detectando o quórum e papel das comunidades interspecíficas nunha enfermidade bacteriana de plantas

Materias

  • Patoxenesis bacteriana
  • Fisioloxía bacteriana
  • , sinal de cela
  • , ecoloxía microbiana

Abstract

Bacterias patóxenas interactúan non só co organismo anfitrión, senón Tamén probablemente coa flora microbiana residente. Na enfermidade dos Nodos de Olive (Olea Europaea), o axente implicado é a bacteria Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV). Dúas especies bacterianas, a saber, os aglomeranos de Pantoea e Erwinia Toletana, que non son patóxenos e que son epífitas e endófitos da oliva, foron moi asociados co nodo da oliveira. Identificamos os sinais químicos producidos polas cepas das tres especies illadas do nodo de oliva e descubriron que pertencían á familia dos sinais QS da lactona N -ayl-homoseerina. Os xenes da familia Luxi / R responsables da produción e resposta a estes sinais nas tres especies bacterianas foron identificadas e caracterizadas. A mutaxénese por inactivación xenómica e experiencias nas plantas demostrou que a virulencia de PSV depende críticamente do QS; Non obstante, a falta de produción de sinal pode ser completada por E. Toletana ou P. aglomerans de tipo salvaxe. Tamén parece que a enfermidade causada por PSV agravada pola presenza das outras dúas especies bacterianas. Neste artigo, discutimos o papel potencial do sistema de control de calidade para establecer un consorcio estable que conduce a unha enfermidade poli-bacteriana.

Introdución

As enfermidades bacterianas resultan da capacidade dos patóxenos Colonizar e regular a expresión de xenes en resposta ao ambiente anfitrión. Como resultado, a maioría dos estudos ata a data foron centrados nas interaccións moleculares entre o servidor e as bacterias. ¿Hai algunha interacción entre o patóxeno e outras bacterias que ocupan o mesmo nicho (“residentes”)? Por exemplo, Sibley et al. (2008) demostrou recentemente que había interaccións bacterianas interspecíficas entre os pseudomonas aeruginosa patóxenos humanos e os residentes bacterianos indíxenas non patóxenos presentes no servidor (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Con este traballo, pretendemos iniciar un estudo sistemático do papel da sinalización interspecífica na patoxénese bacteriana das plantas que utilizan como modelo a enfermidade do nodo de oliva causado polo patóxeno bacteriano pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).

p. Savastanoi está intimamente relacionado con Pseudomonas Syringae, un fitopatóxeno capaz de provocar moitos síntomas en diferentes plantas (Hirano e superior, 2000, HOFTE e Your, 2006). Nos últimos anos, a comprensión dos mecanismos de virulencia de P. Syringae en plantas herbáceas aumentou considerablemente e tamén se secuenciaron varias cepas (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). Doutra banda, o progreso no entendemento P. Savastanoi Patrogenicidade en plantas leñosas foron moi lentas. As cepas de P. Savastanoi poden infectar varias especies de hospedaxe de leite como Olive, Ash e Oleandre, moitas veces provocando un crecemento excesivo de tecidos infectados, causando nodos, posibilidades e crecemento similar ás verrugas (Hirano e superior., 2000, Kennelly et al., 1997). 2007). Distinto patiovares distínguense nesta especie, incluíndo o PV. Savastanoi, PV. Fraxini e PV. Nerii causando nodos e galeses en membros da familia de Oléaceae e Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993).

O PSV é o axente responsable da enfermidade do nodo de oliva No Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993, Hirano e Superior, 2000). Sorprendentemente, moi poucos estudos moleculares sobre os determinantes da viulencia do PSV leváronse a cabo ata agora. Estes estudos iniciais determinaron que un sistema de secreción de tipo III e fitohormonas, ácido indol-3-acético (IAA) e citocininas están implicados no desenvolvemento do nodo. (Suico et al., 1985, Glass and Kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodríguez-Moreno et al., 2008).

Curiosamente, ademais do PSV, outras dúas especies bacterianas Moitas veces asociáronse co nodo da oliveira, a saber Pantoea agglomerans (Gavini et al., 1989, Fernandes e Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) e Erwinia Toletana. (Rojas et al., 2004).Ata a data, algunhas cousas son coñecidas sobre os posibles efectos sinérxicos e comunitarios destas enterobacteriaceae sobre o desenvolvemento de nós. P. aglomerans está moi estendido en moitos hábitats naturais e agrícolas; En particular, está asociado con moitas plantas como un epiphyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Pode frear o crecemento de PSV en olivos probablemente pola produción de antibióticos, ou nalgúns casos tamén aumenta o tamaño dos nodos (Marchi et al., 2006). A súa frecuente presenza e illamento do mesmo ambiente, onde conviven como residentes endófitos comúns dos nodos da oliva, suxiren que poden ocorrer as interaccións, a formación de comunidades e sinerxías. A comunidade bacteriana do nodo de oliva é, polo tanto, un nicho especial para estudar o papel da comunicación interspecífica e a interacción da comunidade entre o patóxeno ea bacteria residente no desenvolvemento da enfermidade.

Unha célula celular Mecanismo de sinalización, coñecido por desempeñar un papel importante na virulencia de bacterias fitopatóxenas, é o sistema de comunicación intercelular do quórum (QS) (Von Bodman et al., 2003). QS regula a expresión de xenes en resposta á densidade celular a través da produción e detección de moléculas de sinal (para revistas, ver referencias de Basser (2002) e Fuqua e Greenberg (2002)). En Bacterias negativas Gram, as moléculas de sinal máis comúns son lactonas de homoseerina N-acil (AHL), que son producidas por unha lactona sintase acyl lousin na maioría dos casos á familia de proteínas Luxi. Un regulador transcripcional / transcrición pertencente á familia Luxr entón forma un complexo co AHLS relacionado coas concentracións de limiar (“Quorum”) que afectan así a transcrición dos xenes obxecto de aprendizaxe (Fuqua et al., 2001). As bacterias na natureza crecen principalmente en forma de consorcios de poli-microbiana, que probablemente implican sinalización interspecífica pola acción de moléculas de sinal difusible (Ryan e Dow, 2008, Duan et al., 2009). A comprensión de sinalización en curso en comunidades poli-bacterianas será un desafío para os futuros estudos, xa que a maioría das enquisas QS centraranse ata agora en configuracións de monocultura.

O papel de AHLS en sinalización interspecífica e a formación das comunidades non está clara E, polo menos, na nosa opinión, non foi suficientemente estudado. Este traballo supón que debe constituír o inicio dun estudo sistemático desta pregunta usando a comunidade de olivos entre PSV, P. agglomerans e E. toletana como un sistema modelo. ¿As tres especies producen sinais AHL e participan na sinalización entre especies? Ata agora, AHL QS considérase específico para cada especie / tensión, pero non está claro se AHL QS ten un papel importante para xogar en nichos que inclúen unha cooperación estable entre diferentes membros bacterianos. Os resultados mostraron que as tres especies teñen sistemas AHL QS que producen AHL similares e en dous casos, producindo o mesmo AHLS. AHL QS foi mostrado aquí por primeira vez como esencial para a patoxenicidade do PSV, porque a virulencia dos mutantes AHL QS-Knockout está moi reducida. Os co-inoculantes en parellas da oliva con residentes de tipo salvaxe e mutantes de PSV ahl synthase restaurar a virulencia total do PSV. Isto demostra que as diferentes especies poden formar consorcios microbianos estables nos que AHL QS desempeña un papel importante. Nos estudos de co-inoculación de plantas tamén demostraron que as sinerxías entre as diferentes especies bacterianas ocorren, indicando que os nodos da oliva poden ser causados por unha enfermidade poli-bacteriana.

cepas bacterianas, plásmidos e fondos

Cepas de PSV, P. aglomerans e E. toletana e os plásmidos utilizados neste estudo están listados na táboa 1. As cepas bacterianas foron cultivadas a 28 ° C nun ambiente mínimo M9 adición de glucosa (Sambrook et al., 1989), no medio B King (King et al., 1954) ou en Luria – Bertani. Seis bacterianos bacterianos AHL foron usados para a detección de AHL: Vioaceum Chromobacterium CVO26 Strain (McClean et al., 1997), Agrobacterium TumeFaciens NTL4 / PZLR4 (Shaw et al., 1997), Escherichia Coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001)., Pseudomonas Putida F117 / Pasc8 e P. Putida F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). As cepas de detector Chromobacterium, Agrobacterium e pseudomonas cultiváronse a 30 ° C como se recomenda, mentres que as cepas de detector de E. Coli cultiváronse a 37 ° C.Os antibióticos nas seguintes concentracións finais foron engadidos segundo o necesario: Ampicillin, 100 μg ML -1; Streptomicina, 100 μg ML -1; tetraciclina, 15 μg ML -1 (E. coli) ou 40 μg ML -1 (pseudomonas); Gentamicin, 10 μg ML -1 (E. coli), 30 μg ML -1 (Agrobacterium) e 40 μg ML -1 (pseudomonas); Kanamycin, 50 μg ML -1 (E. coli e C. Vioaceum) ou 100 μg ML -1 (Pseudomonas, Pantoea e Erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ML -1.

Táboa de tamaño completo

Técnicas de ADN recombinantes

Técnicas de ADN recombinantes, incluída a dixestión á axuda para as enzimas de restrición, o xel de agarosa electroforesis, purificación de fragmentos de ADN, ligadura con ligase T4, recheo final utilizando a enzima de Klenow e e transformación. Coli realizáronse como descrito por Sambrook et al. (1989). Os plásmidos foron purificados usando columnas de Jet Star (Genomed, Löhne, Alemaña); O ADN total de PSV, P. aglomerans e E. toletana foi illado por Lyse sarkosyl-pradnado como anteriormente descrito por mellor et al. (1983). Acoplamentos triarios entre E. coli e PSV, P. aglomerans ou E. toletana realizáronse usando a tensión auxiliar E. coli DH5 (PRK2013). As procuras de homoloxía de ADN realizáronse utilizando a base de datos de Biotecnoloxía Nacional de Biotecnoloxía.

Clonación e inactivación dos xenes QS en P. Savastanoi, P. agglomerans e E. toletana

para PSV DAPP- PG 722 e E. Toletana DAPP-PG 735, dous bancos cosmíticos foron construídos usando a Plauf3 Cosmide (Staskawicz et al., 1987) como Vector. Insercións de ADN foron preparadas por dixestión parcial por Ecori dos DNS DNAS xenómicos, entón cada un foi ligado no sitio correspondente en PLAUFR3. A DNA ligatural foi embalado en X FAGE HEADS usando o extracto de paquete GIGAPACK III Gold (AGILENT TECHNOLOGIES, SANTA CLARA, California, Estados Unidos) e partículas de fago foron transducidas en E. coli HB101 como recomendado polo provedor. Os dous conxuntos de E. Coli HB101, cada un alberga unha biblioteca Cosmid, foi conxugada en masa no Biosensor AHL, C. Violaceum CVO26, como receptor. Cada conxugación resultou nunha transconista: o Cosmide PTH100 do E. Toletana Cosmid Bank DAPP-PG 735 eo Cosmid PJD100 do PSV DAPP-PG 722, que permitiu a cepa CVO26 de producir púrpura e converterse en violeta. O sistema AHL QS de E. Toletana DAPP-PG 735 foi chamado ETOI / R e foi situado nun fragmento Hindiii de 8 KB que foi clonado en PBBRMCS-1, producindo PBBRTOLIR. O sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 foi chamado PSI / R e foi situado nun fragmento NRU i 5800 PB, que foi clonado en PMOSSSIR producindo PMOSBLUE.

Diferentes mutantes cero-xenómicos teñen creado no sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722, P. agglomerans DAPP-PG 734 e E. Toletana DAPP-PG 735 como segue. Para PSV (I), un fragmento interno de 246 PB de PSSI ampliouse a partir do ADN xenómico da tensión DAPP-PG 728 usando o PSI para e PSI Rev (Táboa 1) e (II) un fragmento de 518 pb de PSSR foi amplificado usando os primers PSSR para e PSSR Rev (Táboa 1). Do mesmo xeito, (i) un fragmento interno de 387 PB de PAGI foi amplificado desde o ADN xenómico da tensión DAPP-PG 734 usando Pagi para e Pagi Rev (Táboa 1), deseñada para obter axuda. Xenes publicados de PAGI / R de P. aglomeranos. PV. GYPSOPHILAE (Chalupowicz et al., 2009), e (II) Un fragmento de 561 PB de PAG foi amplificado usando PAG PARA e PAG REV (Táboa 1). Para E. Toletana (I), un fragmento interno de 350 BP de Toli ampliouse a partir do ADN xenómico da tensión DAPP-PG 735 usando o Toli para e Toli Rev (Táboa 1) e ((II) un fragmento de 474 PB de cor. Amplificado usando a Tolr para e Tolr Rev (Táboa 1) Primers. Todos os produtos de PCR mencionados anteriormente foron clonados en PKNock-km dixeridos usando ECO RV, xerando PKKNock-PSI, PKKNOCK-PSSR, PKNOCK-PAGI, PKNOCK-PAG, PKKNOCK-ETOI e PKNOCK-ETOR (Táboa 1). Estes plasmides foron usados como un sistema de administración de suicidio para crear mutantes de inactivación da tensión PSV DAPP-PG 722, P. agglomerans DAPP-PG 734 e E. Toletana DAPP-PG 735 por recombinación homóloga como se describe anteriormente por Alexeyev (1999). Estes experimentos permitiron a creación dos seguintes mutantes xenómicos: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PAG, DAPP-PG 735EO e DAPP-PG 735Etor (Táboa 1). Todos os mutantes foron verificados por PCR utilizando cebadores específicos do vector PKKNock-km e as secuencias de ADN xenómicas e baixadas dos xenes específicos.

Extracción, visualización e cuantificación AHL

As cepas de PSV, P.Os aglomeranos e E. Toletana foron probados por primeira vez para a produción de AHL usando unha análise “T-Trail” nun medio sólido como anteriormente descrito por Piper et al. (1993), usando biosensores AHL (todos revisados por Steindler e Venturi, 2007). A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4), C. Vioaceum CVO26, E. coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) e Pseudomonas F117 (Pasc8) en Luria – Bertani Gellated Plates.

Os AHLS foron purificado a partir do sobrenadante exhausto e separados cunha capa (CCM) tarxeta de cromatografía de capa delgada á cromatografía de fase inversa en C18, como anteriormente descrito por Shaw et al. (1997). Para a visualización en CCM, a placa foi cuberta cunha fina capa de arriba AB Gelled con A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) en presenza de 100 μg ML- 1 de X-GAL como anteriormente descrito por Shaw et al. (1997) ou co Agar Superior de Luria – Bertani sementado con C. Vicaceum CVO26 (McClean et al., 1997).

Detección e identificación AHL por cromatografía de fase líquida de alto rendemento e MS

O AHLS producido por PSV, E. Toletana e P. aglomerans foron identificados por LC / MS / Spectrometry Mass (MS) nun experimento de monitorización multi-reacción como anteriormente descrito por Gould et al. (2006). A vixilancia levouse a cabo sobre a transición do pai iónico a picos dos grupos acil e lactone. Os picos foron comparados cos estándares coñecidos e tamén avaliados pola análise do tempo de retención cromatográfico. Un volume de 200 ml de supernatantes de cultura acelular foi extraído usando o mesmo volume de acetato de etilo, despois da adición de 0, 1% de ácido acético. As fases orgánicas foron separadas e secas baixo unha capucha química. As mostras extraídas para LC / MS / MS foron resuspendidas en 100 μL de acetonitrilo, filtradas nun filtro de 0, 2 μm (Milex LCR4, MilliPore, Billerica, MA, EUA) e diluído a 300 μl con auga de millo que contén 0, 1 % trifluoroacético ácido. Un volume de 100 μL desta solución foi inxectada nun Gemini C 18 de 2, 0 mm por 150 mm (fenomenex, torrance, CA, EUA) que opera a unha velocidade de 200 μl Min -1, o efluente. Fluxo directamente ao Espectrómetro de masas. O disolvente estaba composto por auga que contén 0,05% de ácido trifluoroacético e disolvente B incluíu acetonitrilo que contén 0, 05% de ácido trifluoroacético. A columna foi equilibrada no 20% B durante 15 min, a mostra inxectada e a columna foi lavada por 15 minutos adicionais. Unha elución de gradiente do 20% B a 95% B en 40 minutos foi usada para a separación de AHLS ea columna foi finalmente lavada no 95% B durante 10 minutos antes de reequilibrar.

Probas de motilidade, formación de biofilm A produción de EPS, IAA e Stezhores, Lipase e actividades de proteasas

Actividades proteolíticas e lipolíticas, Swarming e Natación foron determinadas como previamente indicado Huber et al. (2001). O método utilizado para detectar os Steelohores foi adaptado do Agar Agar Chromium-Azurol (Schwyn e Neiland, 1987) Agar Agar Dosing, anteriormente descrito por Caballero-Mellado et al. (2007). A produción de IAA por bacterias foi medida usando unha dosificación de cor como anteriormente descrita por Gordon e Weber (1951) e Vasanthakumar e McManus (2004).

A análise da produción de exoploysaccaride (EPS) de P. Aglomerans e E. Toletana foi probado en reis medios (b) reis, mentres que PSV foi probado nun medio de manitol mínimo de maniito (MM) (0) (0), 2% de extracto de léveda, 2% mannitol, 1, 5 %). % agar). As cepas bacterianas foron cultivadas en caixas de Luria – Bertani, estruturadas para dar colonias individuais e cultivadas a 28 ° C durante 24 horas. As colonias sinxelas foron entón estriadas en KB ou MM Agar e cultivadas durante 48 horas a 28 ° C. As colonias que producen EP teñen un aspecto mucoide fluído, mentres que aqueles con eps deficientes teñen unha morfoloxía non mucoidal separada. E cremoso.

Experimentos en planta

Todos os experimentos planta foron realizados en plantas de oliva (CV. Frantoio) envellecido un ano. Para preparar os inóculos, a bacteria foi cultivada en NA (Agar Nutriente) a 28 ° C durante 48 horas, suspendida en auga desionizada estériles e axustada por espectrofotometría a uns 2 x 10 8 CFU ML -1. Para inoculacións, 10 μL da suspensión bacteriana que contén 10 CFU ML -1 ou auga (para plantas de control) foron colocadas en feridas (3 a 5 por planta) feitas na casca de oliva cun bisturi estéril descrito anteriormente por moretti et al. (2008).As feridas de plantas inoculares e testemuñas foron protexidas con Parafilm M (American National Can, Chicago, IL, EE. UU.). As plantas foron realizadas en caixas de policarbonato transparentes para alcanzar unha alta humidade relativa (90-100%) e mantida nunha cámara de crecemento a 22-24 ° C, cunha iluminación de 70 μE M -2. -1 e un período de luz de 12 h.

No primeiro experimento en Planta, comprobouse se o sistema PSV PSI / R AHL estaba involucrado en patoxenicidade e virulencia. PSV Strain DAPP-PG 722 e Mutantes de Knock-Out de PPSI e PPSR foron inoculados en olivos e a gravidade da enfermidade foi avaliada despois de 60 días medindo a profundidade da proliferación do tecido usando a proliferación de tecidos usando unha escena de Vernier.

No segundo experimento, avaliarase o efecto da co-inoculación de olivos con PSV ou os mutantes respectivos de AHL QS e E. Toletana ou P. aglomerans, así como os seus respectivos mutantes de AHL QS, sobre a gravidade da enfermidade e o crecemento bacteriano nas plantas. despois da inoculación. Para a co-inoculación, as dúas suspensións bacterianas foron mixtas (proporción 1: 1) para obter unha concentración final de 10 CFU ML -1. A gravidade da enfermidade foi gravada por determinar o volume dos nodos, calculado medindo a lonxitude, o ancho e a profundidade (restando o diámetro da vara medida por riba do nodo do que se mediu por baixo do nodo) do nodo a l Axuda con un vencedor (moretti et al., 2008). Para a determinación do crecemento bacteriano, o tecido correspondente ao sitio de inoculación foi excisado e homogeneizado pola ruptura mecánica. As dilucións en serie das suspensións bacterianas resultantes foron distribuídas nas placas e incubadas a 27 ± 1 ° C. Os condes de colonia realizáronse logo de 24 e 48 horas de incubación. As colonias de PSV foron facilmente distinguidas das de E. Toletana e P. agglomerans. As colonias de PSV, cuxo crecemento era máis lento que a de E. Toletana e P. aglomerans, eran pequenos, brancos, cun centro lixeiramente elevado e un bordo transparente plano e ondulado. As colonias de E. Toletana eran marxes non pigmentadas, circulares, convexas, enteiras, fluídos translúcidos e moi mucoides (só tipo salvaxe). As colonias de P. aglomeranos eran amarelas, circulares, lixeiramente convexas, con borde irregular, con superficie máis ou menos arrugada, fluído translúcido e moi mucóide (só tipo salvaxe).

Nas terceiras e cuartas experiencias, O efecto da co-inoculación de oliva con PSV e E. Toletana sobre o crecemento bacteriano foi avaliado 3, 8, 15, 30 e 60 días despois da inoculación (IPR), como se describe na segunda experiencia. Tres plantas replicadas para cada nivel de tratamento ((1) PSV, (2) E. Toletana, (3) PSV + E. Toletana) incluíronse en cada experimento. Para cada planta, os inócios foron colocados en tres feridas feitas en tres posicións diferentes: basal (uns 20 cm por riba do chan), intermedio e apical.

análises estatísticas

Os datos de O primeiro e segundo en experimentos de Planta foron sometidos a unha análise de varianza e as medias foron comparadas pola proba de Duncan multi-praias, usando o software DSAastat V. 1.1 (ONOFRI, 2007).

Os datos do terceiro e cuarto en experimentos de plantas transformáronse en logaritmos básicos (para corrixir a heteroschededasticidade) e foron utilizados para establecer un modelo mixto lineal (Garrett et al. , 2004, Onofri, 2010) que describe a relación entre o número de células bacterianas e a raíz cadrada do tempo (para cada estirpe / grupo) mediante funcións polinómicas da segunda orde. As análises preliminares mostraron que o efecto da posición de inoculación (basal, intermedio e apical) non foi significativo e, polo tanto, engadiuse a posición da planta e inoculación da planta ao modelo como efectos aleatorios, a fin de ter en conta o agrupado Datos. A estimación dos parámetros foi realizada pola máxima probabilidade, como se implementa no paquete NLME no ambiente estatístico R (Venables e Ripley, 2002). Diferenzas entre cepas / grupos en termos de crecemento cinética foron avaliados mediante probas de probabilidade.

secuenciación de ADN e números de acceso de secuencia de nucleótidos

Todas as secuencias de ADN foron realizadas no Cribi Center (Universidade) de Padua, Italia) ou macrogen (www.macrogen.com) e secuencias de nucleótidos foron depositados en Genbank / Embl / DDBJ. O locus ETOI / R QS de E. Toletana DAPP-PG 735 deposítase baixo o número de acceso FN870373, mentres que o locus PSV PSI / R deposítase baixo o número de acceso FN870374.

Produción AHL e sistemas QS de cepas P. Savastanoi, P. agglomerans e E. Toletana

Primeiro, foi interesante determinar se os residentes do patóxeno PSV e a Olive produciu As moléculas de sinalización de AHL QS. Todas as cepas que probamos (Táboa 1) producen compostos AHL como o detectado inicialmente por proba de placa en forma de T en C. Vioaceum CV026 e A. TumeFaciens NTL4 (PZLR4) e E. coli MT102 (PJBA132), Biosensores. Por análise de CCM, inicialmente atribuímos o tipo de AHLS producido por PSV, P. agglomerans e E. Toletana (Figura 1 e Táboa 2). Os resultados mostraron que todas as cepas de PSV e E. Toletana produciron dúas moléculas AHL identificadas provisionalmente como C6-3-OXO-HSL e C8-3OXO-HSL (Figura 1). P. aglomerans, por outra banda, probablemente produciu o C4-HSL e C6-HSL. Para confirmar inequívocamente os AHLs producidos polos tres colorantes, usamos a cromatografía líquida de alto rendemento na fase inversa C 18 ea espectrometría de masas e puideron verificar a produción de 3-OXO-C6-HSL e 3 -O en -C8. -HSL por PSV e E. Toletana e C6-HSL e C4-HSL por P. agglomerans (Figura 1 adicional).

Imaxe

PSV AHL Produción illada de nodos de oliva e laurel-rosa, E. Toletana e P. agglomerans. (a) CCM analiza estándares sintéticos AHL usando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. (b) A análise TLC do AHL producido por sete cepas de PSV usando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. LANES: (1) Strain LMG 2209 T; (2) DAPP-PG 536; (3) DAPP-PG 722; (4) DAPP-PG 723; (5) DAPP-PG 725; (6) DAPP-PG 726; (7) DAPP-PG 728. (C) Análise de CCM do AHL producido por dúas cepas de E. Toletana usando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. LANES: (8) STEM CFBP 6631 T; (9) DAPP-PG 735. (D) Análise TLC de normas sintéticas AHL usando C. Vioaceum CV026 Biosensor como capa de recuperación. (e) Análise de CCM de AHLS producido por P. agglomerans DAPP-PG 734 (Strip 1) usando o C. Vioaceum CV026 Biosensor como capa de recuperación. AHL, homoserina acil de lactona; PSV, PSEUDOMONAS PV. Savastanoi; CCM, cromatografía de capa fina.

imaxe de tamaño completo

Táboa de tamaño completo

O sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722 foi identificado e clonado, como Explicado en materiais e métodos, que consiste nun compañeiro Luxi chamado PSI e un homólogo Luxr chamado PSSR (Figura 2A). O sistema PSI / R ten un alto grao de homoloxía (máis do 90%) co sistema AHLI / R AHL QS de P. Syringae, que responde ao C6-3-OXO-HSL e está involucrado en virulencia (Quinones et Al., 2005). Do mesmo xeito, identificamos e clonou o sistema AHL QS de E. Toletana DAPP-PG 735 (ver a sección MÉTODO e MÉTODOS) que consiste nun deseño designado designado e designado (Figura 2A). O sistema ETOI / R ten unha homoloxía significativa (aproximadamente o 60%) co sistema Erwinia Chrysanthemi PV ExpI / R. Zeae (= Dickeya Zeae), que non só é responsable da produción de C6-3-OXO-HSL, senón tamén da súa resposta (Nasser et al., 1998, Hussain et al., 2008). Foi establecido por PCR, clonación e secuenciación que o sistema AHL QS de P. aglomerans da cepa DAPP-PG 734 foi ortólogo (identidade de máis do 95%) en relación ao sistema PAGI / R de P. aglomerans PV. GYPSOPHILAE (Chalupowicz et al., 2009).

imaxe

AHL Tarxetas xenéticas e produción por mutantes AHL QS-Knockout Aislados de oliva situado en PSV, E. Toletana e P. agglomerans. (A) Mapas xenólicos de PPSI / R e ETOI / R locais clonados de PSV e E. Toletana, respectivamente. Ao ver o sistema PPPSI / R, móstrase que os xenes son ortólogos do xene NCPPB 3335 secuenciado por PSV. De feito, a rexión secuenciada aquí no DAPP-PG Strain 722 é ortólogo da nota NCPPB 3335. ((( B) (a) CCM Análise de estándares sintéticos AHL usando A. TumeFaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. (b) Análise CCM do AHLS producido por PSV PSV DAPP-PG 722 e derivados mutantes usando A. TumeFaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. PSI – é DAPP-PG 722SSII; PSSR – é o DAPP-PG 722SSII. (c) Análise de CCM de AHLS producido pola Mother Strain E. Toletana DAPP-PG 735 e derivados mutantes usando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor como capa de recuperación. Toli- é DAPP-PG 735TOLI; Tolr- é DAPP-PG 735TOLR. (d) Análise TLC de normas sintéticas AHL usando CV026 Biosensor de C.Vioaceum como capa de recuperación. (e) Análise de CCM de AHLS producido pola estirpe de P. Agglomerans DAPP-PG 734 e derivados mutantes usando C. Vioaceum CV026 Biosensor como capa de recuperación. Pagi – é DAPP-PG 734PAG; PAG – é o DAPP-PG 734Pagr. AHL, homoserina acil de lactona; PSV, PSEUDOMONAS PV. Savastanoi; QS, detección de quórum; Savastanoi; CCM, cromatografía de capa fina.

Imaxe de tamaño completo

Os mutantes de Knvout de PSV, P. aglomerans e E. toletana foron xerados tanto nos xenes QS Luxi e Luxr – como descrito na sección Máster e Métodos. Ningún dos mutantes da familia de luxo das tres especies (DAPP-PG 722SSI, DAPP-PG 734PAG e DAPP-PG 738EI “Táboa 1) produciu niveis detectables de AHL cando foi purificado de supernatentes pasados (figura 2b). Este resultado indica que as tres especies probablemente teñen só un sistema AHL QS; Para PSV, esta conclusión é corroborada polo feito de que só unha parella da familia Luxi / R está presente no seu xenoma, que foi recentemente secuenciada (Rodríguez-Palenzuela et al., 2010). Os mutantes da familia Luxr, por outra banda (DAPP-PG 722PSR, DAPP-PG 734Pagr e DAPP-PG 738Etor; Táboa 1) produciron cantidades de AHL similares ás producidas polo tipo salvaxe (Figura 2B), isto que Indica en tres sistemas, non houbo un ciclo de amplificación de sinal a través da regulación xenética de Luxi Familiar. Estas conclusións están baseadas na análise CCM de extractos sobrenatantes agotados de igualdade de cantidade de cultura á mesma fase de crecemento. Esta é unha indicación moi boa, pero as medidas realizadas ao longo da fase de crecemento probablemente confirmarían esta conclusión máis.

$ config non atopado

QS en PSV regula a virulencia nas plantas

para examinar Se o sistema PSV PSA / R AHL estivo involucrado na patoxenicidade e á virulencia, a PSV PSV DAPP-PG 722 e os mutantes de Knock-Out derivados do PPSI e PPSR foron avaliados e a gravidade da enfermidade foi avaliada. Despois de 60 días. Os resultados mostran claramente que as mutacións en PSI e PSSR reduciron significativamente o tamaño dos nodos e, polo tanto, a virulencia dos mutantes (Figura 3A). A profundidade dos nodos foi significativamente reducida (P = 0, 01) nas varas inoculadas cos mutantes DAPP-PG 722SSSI e DAPP-PG 722PSRS en relación a aqueles inoculados co tipo salvaxe que amosan as respectivas reducións duns 80% e 88% (Figura 3b). ) Foi importante, polo tanto, concluíu, ao noso coñecemento, que se descubriu que, por primeira vez, AHL QS xogou un papel central na virulencia de PSV.

imaxe

Papel do QS AHL sobre a formación de nodos de oliva inducido por PSV. (a) Os talos de olivos envelleceron un ano (CV. Frantoio) foron inoculados con 108 mutantes derivados do CFU ML- 1 PSV DAPP-PG 722 (tipo salvaxe: WT), PSSI – e PSSR – e con plantas de control. Os síntomas da enfermidade foron observados 60 días despois da inoculación. Observáronse grandes nodos elevados nas varas inoculadas con DAPP-PG 722 (tipo salvaxe). Os mutantes do déficit en AHL QS PSI – e PSSR – inducido só a proliferación celular limitada, que permaneceu limitada aos bordos da ferida. (b) O tamaño dos nodos estimouse medindo a profundidade da proliferación do tecido en cinco plantas para cada tratamento e para tres nodos por planta. Diferenzas estadísticamente significativas nos nodos entre o tipo salvaxe e os mutantes QS foron determinados pola análise de varianza. Cada valor é a media de cinco repeticións ± desviación estándar. As medias non son significativamente diferentes (p = 0, 01) dependendo da proba múltiple de Duncan. AHL, homoserina acil de lactona; PSV, PSEUDOMONAS PV. Savastanoi; QS, detección de quórum; Savastanoi.

Imaxe de tamaño completo

PSV AHL Synthase Mutantes pode ser gardado pola presenza de E. Toletana e en parte por P. agglomerans

a presenza de e . Toletana e P. aglomeranos nos nodos da oliveira poderían resultar na formación dunha comunidade poli-microbiana co patóxeno de PSV. Dado que E. Toletana e P. aglomerans producen AHLS e que os mutantes de PSV de AHL negativos teñen unha virulencia moi baixa (ver arriba), isto permite unha configuración elegante para establecer se os sinais de AHL son compartidos e se se forman as comunidades interspecíficas no Nodo Olivier. .

Como E. Toletana produce estruturalmente o mesmo AHL como PSV (ver arriba), inicialmente foi posto en marcha unha co-inoculación en Planta. O Mutante PSI AHL Synthase foi usado para a cofección de plantas de oliva con E. Toletana Damp-.Tensión de tipo salvaxe PG 735. Esta co-inoculación permitiu ao PSV PPSI Mutante para inducir a formación de nós, así como a tensión de tipo salvaxe (Figura 4). Isto pode ser atribuído ás dúas cepas formando un consorcio, onde E. Toletana proporciona o AHLS no DAPP-PG 722SSIS, que é capaz de inducir a expresión do xene obxectivo do AHL QS que provoca a formación de nodos D ‘Olive. As inoculacións similares en parellas tamén se realizaron co tipo salvaxe DAPP-PG 734 de P. aglomerans e, neste caso, observouse unha restauración parcial da formación de nodos (Figura 4). Isto podería deberse ao feito de que P. aglomerans produce diferentes AHLS de PSV, aos que o sistema PSI / R probablemente respondeu con menos eficiencia. Importalmente, parella en Inoculacións de Planta con E. Toletana ou o P. agglomerans AHL Synthase Mutant, Etoi Gold Pagi, respivectivamente, non restauraron o adestramento de oliva. Isto claramente índices que intercambios a comunicación a través do intercambio de AHLS foi clave nos experimentos de co-inoculación anteriores onde os mutantes de PSV AHL Synthase foron copulsados de forma independente coas dúas cepas de tipo salvaxe (Figura 4).

imaxe

efecto de co-inoculación de plantas de oliva (CV. Frantoio) con PSV e E. Toletana, P. aglomerans e os respectivos mutantes de AHL QS. PSV: As columnas indican o efecto sobre a gravidade da enfermidade, expresada como volume de nó (60 días despois da inoculación), de inoculación da WT PSV (columnas eclosionadas), dos mutantes con discapacidade QS de PSV (columnas brancas representan PSI mutante e columnas negras PSSR Mutantes) só ouro en combinación con P. aglomerans (PAG) ou E. Toletana (e) e relativo QS-impares mutantes, Pagi, PAG, ETOI e EOR. As plantas de control de oliva foron inoculadas con auga de distancia (columna gris). Cada valor é a media de cinco replicacións ± sexo seguido polas mesmas letras non son estatisticamente diferentes en P = 0.05 (proba de rango múltiple de Duncan). AHL, acilo homoserina lactone; PSV, PSEUDOMONAS PV. Savastanoi; Qs, sensación de quórum.

imaxe de tamaño completo

O PSV PSSR Mutant COUD non se completará para a formación de olivar por E. Toletana e P. agglomerans; O motivo máis probable é que o mutante PSV PPSR non pode responder a AHLS. Estes resultados tamén indican que E. Toletana e P. agglomerans Steatas de tipo salvaxe non poden causar enfermidades só en ausencia de PSV de tipo salvaxe. Importy, en todos os experimentos de co-inoculación, as cantidades comparables das unidades de formación de colonia de PSV (CFU) estiveron presentes no sitio de inoculación (Figura 5).

Imaxe

Efecto sobre os niveis de PSV de co-inoculación de plantas de oliva (CV. Frantoio) con PSV e E. Toletana, P. Aglomeranos e os respectivos mutantes AHL QS. PSV: as columnas negras indican o efecto sobre o crecemento bacteriano da planta (60 días despois da inoculación) da inoculación dos mutantes de prexuízo de PSV da mesma bacteria PSI (columnas brancas) PSSR de ouro (columnas eclosionadas) só ouro en combinación con p . Aglomerans (PAG) ou E. Toletana (e) e relativo QS-mutantes impares, Pagi, PAG, ETI e ETR. Cada valor é a media de cinco replicacións ± sexo seguido polas mesmas letras non son estatisticamente diferentes en P = 0.05 (proba de rango múltiple de Duncan). PSV, PSEUDOMONAS PV. Savastanoi.

Imaxe de tamaño completo

Concluíuse que ambos E. Toletana e P. aglomerans poden formar comunidades estables interspecies con PSV e que a comunicación a través do intercambio de sinais de AHL estaba a suceder en Planta.

Papel da sinalización de interspecies e consorcios de parella en enfermidade de oliva

Como evidente dos resultados descritos anteriormente, as comunidades bacterianas de PSV con E. Toletana e P. aglomerans. Para comezar a comprender o papel e o resultado das interaccións positivas entre estas tres especies bacterianas, a virulencia de PSV en presenza das outras dúas bacterias residentes de nó oliveiras foi probada en Planta. As plantas de oliva de antigüidade foron inoculadas por cada tensión bacteriana con 10 μL dun bacteriano que ten suspensión 10 8 CFU ML -1. Como se mostra na Figura 4, a mellora significativa da virulencia de PSV en presenza de E. Toletana foi observada como indicada por un aumento considerable (case o 30%) do volume de nó. Isto indicou que E. Toletana contribúe á patoxenicidade de PSV; O aumento da virulencia non era por mor dos cambios nos niveis de PSV na co-inoculamento xa que era unha diferenza significativa na carga bacteriana (Figura 5). A mesma contribución á virulencia de PSV foi observada cando co-inoculamento co E. Toletana AHL Mutant Syntase; Non se pode exclusivo, con todo, que os sinais de PSV AHL son percibidos por E. Toletana. Ningún aumento da virulencia, por outra banda, foi observado cando P.Aglomerans foi co-inoculado con PSV, e de feito observouse unha lixeira diminución do volume de nó. Cando se co-inoculamento co p. Aglomerans AHL Synthase Mutant, con todo, detectouse un aumento significativo no adestramento de volume de nó, o que significa que QS regula algúns factores en P. aglomerans, que limitan o crecemento PSV e / ou a expresión de xenes.

Seguindo os resultados obvios sobre a natureza poli-bacteriana da enfermidade e sobre o intercambio de sinais AHL entre PSV e E. Toletana, era interesante comprender mellor esta comunidade bacteriana. O impacto da co-inoculación sobre a dinámica de crecemento destas bacterias foi determinada en dous experimentos distintos. Dado que os resultados destes experimentos son similares, só se informaron datos dun dos experimentos. Por conseguinte, a co-inoculación foi realizada e as poboacións bacterianas foron determinadas ata 60 DPI. Cando o PSV DAPP-PG 722 foi inoculado só, un aumento de 10 veces podería ser detectado na poboación bacteriana illada de 8 ppi tecido inoculado (preto de 10 7 cfu por sitio) (figura 6a, círculos baleiros). A poboación PSV aumentou gradualmente a preto de 1, 5 × 10 8 CFU por sitio a 60 DPI. Cando se realizou unha inoculación mixta con E. Toletana DAPP-PG 735 (Figura 6A, Círculo completo), o crecemento da PSV aumentou significativamente (proba da relación de probabilidade con P < 0 , 0001), mentres que cando E. toletana foi inoculada só no tamaño das súas poboacións (figura 6b, triángulo aberto). Doutra banda, o crecemento de E. Toletana non podería ser descrito adecuadamente usando un modelo polinómico de segunda orde, pero foi estimulado significativamente a 30 DPI (o erro de diferenza estándar foi de 0, 018) en presenza de PSV (Figura 1). 6b, triángulo completo), e despois de 60 DPI, o tamaño da poboación resultante da infección mixta foi de aproximadamente 103 veces maior que o obtido por inoculacións simples. Estes resultados son unha indicación adicional da relación íntima e mutua entre PSV e E. toletana no nodo de oliva, obtendo un agravamento dos síntomas da enfermidade, o intercambio de sinais de AHL QS e un aumento do crecemento bacteriano. De ambas especies.

imaxe

As poboacións de persoas dinámicas de DAPP-PG 722 e E. Toletana DAPP-PG 735 Inoculouse en talos de oliva (CV. Frantoio), só ou en combinación. (a) Crecemento do PSV só (liña continua e círculo aberto) ou en combinación con E. Toletana (liña punteada e círculo cheo). (b) Crecemento de E. Toletana só (liña completa e triángulo aberto) ou en combinación con PSV (triángulo punteado e completo). Os símbolos indican as contas observadas e as liñas indican o axuste do modelo mixto lineal. O erro típico dunha media foi 0, 013.

imaxe de tamaño completo

Proba de regulación dependente de AHL de varios fenotipos en P. Savastanoi, p. Aglomerans e E. toletana

Para establecer o posible papel dos sistemas AHL QS en bacterias asociadas a Olive Nodes, probáronse varios fenotipos importantes para a regulación de AHL QS nas tres especies. Unha lista de todos os fenotipos probados para a regulación AHL QS resúmese na táboa 2.

Curiosamente, determinamos que P. agglomerans DAPP-PG 734 e E. Toletana DAPP-PG 735 tamén producen IAA. Probamos os tipos salvaxes PSV (DAPP-PG 722), P. agglomerans (DAPP-PG 734), E. Toletana (DAPP-PG 735) e os seus mutantes derivados (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SSR, DAPP-PG 734pagi, DAPP-PG 734PAG, DAPP-PG 735Eto e DAPP-PG 735ET) Para a produción de IAA. Do mesmo xeito, verificamos se AHL QS estaba involucrado na produción de Steelohores, a produción de EPS, as actividades proteolíticas e lipolíticas secretadas e a motilidade nadando e de Swarming. Os resultados destas investigacións resúmense na táboa 2. Sorprendentemente, na maioría das probas, non se observaron diferenzas significativas entre as cepas de motores e os seus derivados de Mutante QS nas condicións probadas. A produción de PES foi probada cualitativamente nunha proba de placa en todas as cepas salvaxes e mutantes. Os dous mutantes AHL QS da tensión PSV DAPP-PG 722 mostraron unha clara redución na produción de PES en relación ao tipo salvaxe (datos non presentados); A produción de PES foi restaurada cando o mutante DAPP-PG 722PSI foi cultivado en presenza de exóxeno C6-3-OXO ou C8-3OXO-HSL (datos non presentados). Do mesmo xeito, para P.Aglomeranos, a inactivación de Pagi resultou nunha redución da produción de PES; Non obstante, non se observou ningunha redución no Mutante de PADR en relación ao tipo salvaxe. A produción de EPS foi restaurada cando o mutante DAPP-PG 734PAGI foi cultivado en presenza de C4-HSL ou C6-HSL (datos non presentados). A produción de EPS tamén foi reducida no mutante E. Toletana DAPP-PG 735eto con respecto ao do tipo salvaxe, e a complementación por adición exógena C6-3-OXO-HSL ou C8-3OXO-HSL restaurou a produción de EPS .. Non obstante, en E. Toletana, a inactivación do Etch aumentou considerablemente a produción de PES (datos non presentados).

Discusión

Ata a data, moitos estudos demostraron que o bacteriano As enfermidades das plantas resultaron de interaccións complexas entre o patóxeno eo anfitrión. A interacción do patóxeno coa flora bacteriana residente é moito menos estudada e entendida. ¿As bacterias fitopatóxenas forman comunidades bacterianas estables con outras bacterias residentes non patóxenas? Son estas redes de asociación na orixe dunha infección multi-microbiana? A sinalización intercelular ten un papel que xogar ao establecer estes consorcios bacterianos? Estas son as preguntas que comezamos a abordar aquí usando a comunidade bacteriana presente na enfermidade do nodo de oliva. Este nicho é creado polo patóxeno PSV; Non obstante, varias outras especies bacterianas de residentes non patóxenas foron illadas neste ambiente, a maioría das veces E. Toletana (Rojas et al., 2004) e P. aglomerans (Marchi et al., 2006). As principais conclusións deste traballo son que (i) as tres especies illadas do nodo Olivier producen sinais AHL e teñen un sistema AHL QS; En particular, E. Toletana e PSV producen o mesmo AHLS, (II) AHL QS en PSV é esencial para a virulencia porque os mutantes de knock-out son fundamentalmente non virulentos, (III) PSV Os mutantes de AHL Synthase poden ser gardados por E. Toletana e En parte por P. aglomerans, destacando o intercambio de sinais AHL ea formación de comunidades bacterianas estables e (iv) E. Toletana forman comunidades na planta, actuando como patóxeno asociado en sinerxías co patóxeno principal de PSV, as co-inocupacións aumentan O número de bacterias de ambas especies e a gravidade da enfermidade. Todos os mutantes bacterianos construídos neste estudo foron producidos durante eventos de recombinación homólogos e tamén implican insercións plásmidas. Polo tanto, é posible que os nosos experimentos realizados en plantas sen selección de antibióticos leven a un retorno de mutantes ao tipo salvaxe. Como todas as experiencias de supervisión do noso estudo non levaron a un comportamento de tipo salvaxe, concluímos que non se produciron comentarios significativos.

Actualmente, os únicos determinantes moleculares coñecidos polo desenvolvemento do desenvolvemento do nodo en PSV é o sistema de secreción de tipo III (Sisto et al., 2004) e fito-hormonas e citocinina (IAA Suízo et al., 1985, vidro e Kosuge, 1988, Rodríguez-Moreno et al., 2008). Ahl QS agora pode ser engadido a esta lista e, ao noso coñecemento, é o primeiro sistema regulador vinculado á viulencia do PSV. Ahl QS probablemente non afectará a colonización inicial, senón a expresión xenética da virulencia asociada a densidades de alta poboación. Agora sería relevante determinar se AHL QS está involucrado na regulación dos tres determinantes da virulencia identificada ata a data. Probablemente, AHL QS tamén regula moitos outros factores de virulencia. A recente secuenciación do xenoma de PSV destacou a presenza de moitos loci que pode estar involucrada en virulencia, incluíndo cinco sistemas de secreción diferentes, efectos tipo III, compostos fenólicos, quimiotaxis, motilidade, adhesivos e xenes de toxina (Rodríguez-Palenzuela). et al., 2010). Informamos que a produción de PES está regulada polo sistema PSV PSC / R; Non obstante, non está claro se o EPS está involucrado no proceso da enfermidade. A SPE, por exemplo, é un factor de virulencia e está regulado por AHL QS. Está intimamente relacionado con P. Syringae (Quinones et al., 2005).

A vida das bacterias dentro do nodo é descoñecida no sentido amplo. Un estudo recente, con todo, demostrou que a PSV crea o nodo formando agregados bacterianos, microcolonia e biofilmios multicapa (Rodríguez-Moreno et al., 2009, Pérez-Martinez et al., 2010). Sabemos pouco sobre os efectos de P. agglomerans e E.Toletana sobre o desenvolvemento de nós ea posible formación e estabilidade do consorcio bacteriano mulsispecífico formado no nodo de oliva. P. aglomerans está moi estendido en moitos hábitats naturais e agrícolas; En particular, está asociado con moitas plantas como un epiphyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Ademais, P. aglomerans pode ser convertido nun patóxeno tumorigénico específico do servidor, unha bacteria comensal e epífita asociada a moitas plantas, adquirindo unha illa de patoxenicidade transmitida por un plásmido (Barah e Manulis-Sasson, 2007).

Os AHLs producidos por E. Toletana (C6-3-OXO-HSL e C8-3OXO-HSL) son os mesmos que os producidos por PSV. Esta é a proba de que pode haber sinalización interspecífica a través do AHL entre as dúas especies cando ocupan o mesmo nicho. P. aglomerans, por outra banda, produce C4-HSL e C6-HSL; Non podemos excluír que PSSR e / ou etor son capaces de responder a estes AHLS. Do mesmo xeito, non sabemos se o PAG tamén pode responder a AHLS producido por E. Toletana e PSV. Os nosos estudos que inclúen a co-inoculación binaria en Planta demostraron que E. Toletana pode gardar PSV Mutantes PSI AHL sintase pola súa capacidade de inducir os nodos de oliva. Dado que os síntomas colocan polo menos 25 a 30 días para crecer, este resultado suxire que. Toletana e PSV son capaces de formar un consorcio estable, onde as dúas especies sofren unha sinalización interspecífica e un compartición de AHL. P. aglomerans tamén pode aforrar, en parte, o PPSI PPSI mutante; O motivo deste rescate parcial é que o AHLS producido por P. aglomerans non está ben recoñecido pola PSSR, ou que o consorcio non é tan estable como para E. Toletana. É posible que neste nicho, o que permite que un consorcio creza, para fomentar a aparición de trampas bacterianas (por exemplo, os tramposos cegos do sinal, que non responden aos sinais AHL), que non contribúen a A comunidade pode beneficiarse de “factores” ou “bens públicos” producidos por QS cooperators (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Moitos outros illados bacterianos deben estar illados deste nicho para determinar esta posibilidade.

A capacidade de PSV para inducir a formación de nodos de oliva baséase na súa capacidade de regular a expresión dos xenes en resposta. Ao Ambiente do servidor. Tamén comezamos a preguntarnos se a microflora arorulenta aborígena contribúe á enfermidade causada por PSV. A co-inoculación de E. Toletana con PSV resultou un aumento significativo no volume de nodos de oliva, indicando que este consorcio probablemente sexa moi estable e que PSV beneficia da presenza de E. Toletana e quizais ata o reverso. Tamén é importante ter en conta que os estudos de co-inoculación determinaban que E. Toletana e Viceversa estimularon significativamente o crecemento do PSV no nodo de oliva, o que indica unha estreita asociación entre o metabolismo, os nutrientes e o sinal entre as dúas especies bacterianas. Este efecto sinérxico de E. Toletana con P. Savastanoi claramente indica unha vantaxe mutua para ambas as especies se crecen e comparten o mesmo nicho. A comprensión dos mecanismos de cooperación e comunicación destas dúas bacterias iluminará o proceso de comunicación interspecífica. E. Toletana non é patóxeno cando está inoculado co mutante de PSSR de AHL QS PSV, pero pode servir como patóxeno de accesorios cando é consorcio con PSV de tipo salvaxe. É posible que a expresión dos xenes de PSV poida ser influenciada pola presenza de residentes bacterianos ou o consorcio microbiano estabiliza o PSV metabólico. A co-inoculación de P. aglomerans con PSV, por outra banda, resultou nunha redución do volume do nodo, que aumentou cando o co-inoculante foi o Pagi do Mutante AHL Synnase. P. aglomerans é máis probable que produza e AHL QS regula o factor que afecta a PSV e cando a produción é reducida, P. aglomerans tamén pode actuar como un patóxeno de accesorios.

Hai moito. Poucos informes Sobre a contribución / rol da flora microbiana aborixinal residente do anfitrión sobre a acción dun patóxeno entrante. É interesante notar que en 1998 informouse que na rizesfera de trigo, hai unha poboación interolonada de especies bacterianas que posiblemente poden compartir moléculas de AHL (Pierson et al., 1998). Dous estudos recentes demostraron que a microflora indígena tivo unha influencia sobre a virulencia de P. aeruginosa e que tamén afecta aos perfís de expresión xenética dos factores asociados á virulencia (Duan et al., 2003, Sibley e Al., 2008). ..Actualmente non está claro se hai sinalización de sinal entre estas bacterias; Observouse que o sinal AI (autoinuzer) -2 produce tanto as bacterias de gramo positivo como Gram negativo podería ser un sinal interespecífico nesta comunidade (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). É interesante notar que Dulla e Lindow (2009) informaron moi recentemente que as bacterias epífitas indíxenas producen a mesma P. Syingae p. As xeringas poden eliminar e interferir co proceso causando a enfermidade. Este traballo destacou un diálogo transversal na filosfera da planta a través de AHL, que resultou en cambios no comportamento (principalmente motilidade, o que significa menos invasión) e, polo tanto, a virulencia de P. Syingae PV. Syringae. A aparición da enfermidade durante a co-inoculamento con bacterias epífitas productoras de AHL reduciuse nun 50%. Crese que isto é debido á indución prematura e prematura de AHL QS que afectan a expresión de factores asociados por virulencia. Este exemplo mostra que a comunicación interspecífica con flora bacteriana indíxena tamén pode ter consecuencias negativas para os axentes fitopatóxicos.

Os datos presentados aquí reforzan aínda máis a aparente complexidade das infeccións poli-microbianas; Os nosos resultados indican un papel de compartir a AHL e a sinalización interspecífica, que proporciona un excelente modelo de traballo para profundar nas interaccións entre comunidades bacterianas. Este estudo céntrase nas interaccións mediadas por AHL en hábitats naturais; Ata agora, o papel de QS nas bacterias asociadas ás plantas foi estudado case exclusivamente con cepas únicas, a pesar da posibilidade de sinalización interspecífica que pode ser mediada polo intercambio de moléculas de sinal AHL nas comunidades microbianas mixtas. As interaccións entre as bacterias do medio natural son complicadas por unha serie de factores, incluída a resposta do servidor, os parámetros ambientais ea composición específica da comunidade. Suxírese que os futuros estudos deberán desenvolver sistemas in vitro para a comprensión práctica e detallada das interaccións das especies. Acabamos de comezar a desenvolver ferramentas para estudar interaccións microbianas no medio natural.

Os nosos estudos futuros centraranse na estabilidade e papel que desempeñan cada especie neste consorcio microbiano. PSV pode considerarse como o creador de nicho ou o líder deste consorcio, mentres que P. aglomerans e E. toletana son ocupantes ou residentes de nichos, que poden, con todo, converterse en patóxenos auxiliares en presenza dun nicho fabricante. Na actualidade, non está claro se estes consorcios patóxenos teñen unha razón común. Supoñemos que o consorcio dos nodos de oliva evolucionou para converterse en estable e cooperativa porque o aumento da piscina xenética eo repertorio metabólico combinado aumentan as posibilidades de supervivencia dos participantes en diversas condicións (Venturi et al., 2010). Este traballo suxire que os procesos complexos de comunicación entre especies poden ser necesarias para a formación de tal consorcios.

Genbank / Embl / DDBJ

Deixa unha resposta

O teu enderezo electrónico non se publicará Os campos obrigatorios están marcados con *