Sinais de compartilhamento detectando o quorum e o papel das comunidades interspecíficas em uma doença bacteriana de plantas

assuntos

  • patogênese bacteriana
  • fisiologia bacteriana
  • , sinal de célula
  • , ecologia microbiana

abstrato

interagir não apenas com o organismo de host, mas também provavelmente com a flora microbiana residente. Na doença dos nós de oliveira (Olea Europaea), o agente envolvido é a bactéria Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV). Duas espécies bacterianas, nomeadamente pantoea aglomerans e Erwinia Toletana, que não são patógenos e que são epifytes e endophytes da oliveira, foram muitas vezes associados ao nó da oliveira. Identificamos os sinais químicos produzidos pelas cepas das três espécies isoladas do nó de oliva e descobriram que pertenciam à família dos sinais do QS da lactona N-ayl-homosserina. Os genes da família Luxi / R responsável pela produção e resposta a esses sinais nas três espécies bacterianas foram identificadas e caracterizadas. A mutagênese por inativação genômica e experiências em plantas mostraram que a virulência do PSV depende criticamente do QS; No entanto, a falta de produção de sinal pode ser completada por E. Toletana ou P. Agglomerans de tipo selvagem. Parece também que a doença causada pela VGV é agravada pela presença das outras duas espécies bacterianas. Neste artigo, discutimos o papel potencial do sistema de controle de qualidade no estabelecimento de um consórcio estável que leva a uma doença poliactial.

introdução

As doenças bacterianas resultam da capacidade dos patógenos para colonizar e regular a expressão de genes em resposta ao ambiente anfitrião. Como resultado, a maioria dos estudos até a data foi centrada nas interações moleculares entre o hospedeiro e as bactérias. Existem interações entre o patógeno e outras bactérias que ocupam o mesmo nicho (“residentes”)? Por exemplo, Sibley et al. (2008) demonstrou recentemente que havia interações bacterianas interspecíficas entre os residentes bacterianos indígenas e não-patogênicos não-patogênicos de Pseudomonas Aeruginosa, presentes no anfitrião (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Com este trabalho, pretendemos iniciar um estudo sistemático do papel da sinalização interspecífica na patogênese bacteriana das plantas usando como modelo a doença do nó oliva causado pelo patógeno bacteriano Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).

p. Savastanoi está intimamente relacionado a Pseudomonas Syringae, um fitopatógeno capaz de provocar muitos sintomas em diferentes plantas (Hirano e superior, 2000, Hofte e Your, 2006). Nos últimos anos, a compreensão dos mecanismos de virulência de P. Syringee em plantas herbáceas aumentou consideravelmente e várias cepas também foram sequenciadas (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). Por outro lado, progresso na compreensão P. Savastanoi patogenicidade em plantas lenhosas eram muito lentas. As estirpes de P. Savastanoi podem infectar várias espécies hospedeiras lenhosas, como oliveira, cinzas e oleandre, muitas vezes provocando um crescimento de tecidos infectados, causando nós, chances e crescimento semelhantes às verrugas (Hirano e superior., Kennelly et al., 2000, 1997). 2007). Diferentes pathos são distinguidos nesta espécie, incluindo o PV. Savastanoi, PV. Fraxini e PV. Nerii causando nós e Gales em membros da família de Oléaceae e Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian and Mansfield, 1993).

O PSV é o agente responsável pela doença do nó de azeite No Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993, Hirano e Upper, 2000). Surpreendentemente, muito poucos estudos moleculares sobre os determinantes da viulência da VGV foram realizados até agora. Esses estudos iniciais determinaram que um sistema de secreção tipo III e fitohormônios, ácido indole-3-acético (IAA) e citocininas estão envolvidos no desenvolvimento do nó. (Suico et al., 1985, vidro e Kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodriguez-Moreno et al., 2008).

Curiosamente, além do PSV, duas outras espécies bacterianas Ter frequentemente associado ao nó da azeitona, nomeadamente pantoea agglomerans (Gavini et al., 1989, Fernandes e Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) e Erwinia Toletana. (Rojas et al., 2004).Até o momento, poucas coisas são conhecidas sobre os possíveis efeitos sinérgicos e comunitários destes enterobacteriaceae sobre o desenvolvimento de nós. P. Agglomerans é generalizada em muitos habitats naturais e agrícolas; Em particular, está associado a muitas plantas como epifyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Pode restringir o crescimento do VGV em oliveiras provavelmente pela produção de antibióticos, ou em alguns casos também aumentam o tamanho dos nós (Marchi et al., 2006). Sua freqüente presença e isolamento do mesmo ambiente, onde coexistem como residentes comuns de endófitas dos nós da azeitona, sugerem que as interações, a formação de comunidades e sinergias poderiam ocorrer. A comunidade bacteriana do nó oliva é, portanto, um nicho especial para estudar o papel da comunicação intersecífica e a interação da comunidade entre o patógeno e a bactéria residente no desenvolvimento da doença.

uma célula-célula Mecanismo de sinalização, conhecido por desempenhar um papel importante na virulência de bactérias fitopatogênicas, é o quorum sensor de sistema de comunicação intercelular (QS) (von Bodman et al., 2003). O QS regula a expressão de genes em resposta à densidade celular através da produção e detecção de moléculas de sinal (para revistas, ver referências de Basser (2002) e Fuqua e Greenberg (2002)). Em bactérias gram negativas, as moléculas de sinal mais comuns são lactonas de homosserinas N-acil (AHL), que são produzidas por uma lactona sintase acil Lousin na maioria dos casos para a família de proteína Luxi. Um regulador de transcrição / transcrição pertencente à família Luxr, em seguida, forma um complexo com os AHLs relacionados a concentrações de limiar (“quorum”) afetando assim a transcrição dos genes alvo (Fuqua et al., 2001). As bactérias na natureza crescem principalmente na forma de consórcios poli-microbianos, o que provavelmente envolve sinalização interespecífica pela ação de moléculas de sinal difusíveis (Ryan e Dow, 2008, Duan et al., 2009). Compreender a sinalização contínua em comunidades poli-bacterianas será um desafio para estudos futuros, pois a maioria das pesquisas QS se concentraram até agora nas configurações de monocultura.

O papel dos AHLs em sinalização interspecífica e o treinamento de comunidades não é claro E, pelo menos em nossa opinião, não foi suficientemente estudado. Este trabalho deve constituir o início de um estudo sistemático desta questão usando a comunidade de nós de oliveira entre a PSV, P. Agglomerans e E. Toletana como um sistema de modelo. As três espécies produzem sinais AHL e participam na sinalização entre espécies? Até agora, o AHL QS é considerado específico para cada espécie / tensão, mas não está claro se AHL QS tem um papel importante a desempenhar em nichos envolvendo uma cooperação estável entre diferentes membros bacterianos. Os resultados mostraram que as três espécies têm sistemas AHL QS produzindo AHL semelhantes e em dois casos, produzindo os mesmos AHLs. Ahl QS foi mostrado aqui pela primeira vez como essencial para a patogenicidade do PSV, porque a virulência dos mutantes AHL QS-Knockout é bastante reduzida. Os co-inoculantes em pares da oliveira com residentes do tipo selvagem e mutantes PSV AHL sintase restaurar a plena virulência do PSV. Isso mostra que diferentes espécies podem formar consórcios microbianos estáveis em que AHL QS desempenha um papel importante. Nos estudos de co-inoculação da Planta demonstraram também que as sinergias entre as diferentes espécies bacterianas ocorrem, indicando que os nós da oliveira podem ser causados por uma doença poliactial.

Cepas bacterianas, plasmídeos e fundos

cepas de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. As cepas bacterianas foram cultivadas a 28 ° C em um ambiente mínimo M9 adição de glicose (Sambrook et al., 1989), no meio B do rei (King et al., 1954) ou em Luria – Bertani. Seis Biossensores Bacterianos AHL foram utilizados para a detecção de AHL: Tensão CVO26 de ViOaceum Chromobacterium (McClean et al., 1997), Agrobacterium tumefaciens NTL4 / PZLR4 (Shaw et al., 1997), Escherichia Coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001). Pseudomonas Putida F117 / PASC8 e P. PUTIDA F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). As cepas de detector de cromobacterium, agrobacterium e pseudomonas foram cultivadas a 30 ° C, conforme recomendado, enquanto as estirpes de detector de E. coli foram cultivadas a 37 ° C.Os antibióticos nas seguintes concentrações finais foram adicionados conforme necessário: ampicilina, 100 μg mL -1; Estreptomicina, 100 μg ml -1; tetraciclina, 15 μg ml -1 (E. coli) ou 40 μg mL -1 (pseudomonas); gentamicina, 10 μg ml -1 (E. coli), 30 μg mL -1 (agrobacterium) e 40 μg ml -1 (pseudomonas); Kanamycin, 50 μg ml -1 (E. coli e C. vioaceum) ou 100 μg mL -1 (pseudomonas, pantoea e erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ml -1.

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Técnicas de DNA recombinante

Técnicas de DNA recombinante, incluindo digestão ao auxílio para enzimas de restrição, agarose gel Eletroforese, purificação de fragmentos de DNA, ligação com ligase T4, enchimento final usando a enzima Klenow e transformação de E. Coli foram realizados como descrito por Sambrook et al. (1989). Os plasmídeos foram purificados usando colunas de Jet Star (genomed, Löhne, Alemanha); O DNA total de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana foi isolado pela Lyse Sarkosyl-Pronase, como descrito anteriormente por Better et al. (1983). Acoplamentos tripáticos entre E. coli e PSV, P. Agglomerans ou E. Toletana foram feitos usando a cepa auxiliar E. coli dh5 (PRK2013). As buscas de homologia de sequência de DNA foram realizadas usando o banco de dados National Biotechnology Center Blast Blast.

Clonagem e Inactivation de QS Genes em P. Savastanoi, P. Agglomerans e E. Toletana

para PSV Dapp- PG 722 e E. Toletana Dapp-pg 735, dois bancos cosmid foram construídos usando o Cosmide Plauf3 (Staskawicz et al., 1987) como vetor. As inserções de DNA foram preparadas por digestão parcial pela ECORI dos dois DNAs genómicos, cada uma foi ligada no local correspondente em PLAF3. A DNA de ligadura foi então embalada em cabeças de phage usando o Extracto de Pacote Gigapack III Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, Estados Unidos) e partículas de fagos foram transduzidas em E. coli HB101, conforme recomendado pelo fornecedor. Os dois conjuntos de E. coli HB101, cada um abriga uma biblioteca cósmida, eram conjugados em massa no Biossensor AHL, C. Violaceum CVO26, como receptor. Cada conjugação resultou em um transconjetante: o Cosmide Pth100 do banco Cosmid E. Toletana DAPP-PG 735 e o Cosmid PJD100 do PSV Dapp-PG 722, que permitiu a cepa CVO26 de produzir arroxeado e se tornar violeta. O sistema AHL QS de E. Toletana DAPP-PG 735 foi chamado de EtOI / R e está localizado em um fragmento de 8 kb hindiii que foi clonado em PBBRMCS-1, produzindo pbbrtolir. O sistema AHL QS do PSV DAPP-PG 722 foi chamado PSI / R e está localizado em um fragmento NRU I 5800 PB, que foi clonado em PMOSSSIR produzindo PMOSBLUE.

Diferentes mutantes genômicos zero têm Foi criado no sistema AHL QS de PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans DAPP-PG 734 e E. Toletana DAPP-PG 735 da seguinte forma. Para a PSV (I), um fragmento interno de 246 pb de PSSI foi amplificado a partir do DNA genómico da tensão DAPP-PG 728 utilizando o PSI para e PSI Rev (Tabela 1), e (ii) um fragmento de 518 pb de O PSSR foi amplificado usando os primers PSSR e PSSR REV (Tabela 1). Da mesma forma, (i) um fragmento interno de 387 PB do PAGI foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa DAPP-PG 734 usando o Pagi para e o Pagi Rev (Tabela 1), projetado para ajuda. Genes publicados de Pagi / R de P. Agglomerans. PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009), e (ii) um fragmento de 561 PB de Pragt foi amplificado utilizando PraGRA e PRAGR REV (Tabela 1). Para E. Toletana (I), um fragmento interno de 350 BP de Toli foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa DAPP-PG 735 utilizando os primers Toli e Toli Rev (Tabela 1) e (ii) um fragmento de 474 PB de Etor. amplificado utilizando os primers Tolr e Tolr Rev (Tabela 1). Todos os produtos de PCR mencionados acima foram clonados em pkknock-km digeridos usando eco rv, gerando pknock-psi, pknock-pssr, pknock-pagi, pknock-prag, pknock-etoi e pknock-eter (Tabela 1). Estes plasmídeos foram então utilizados como um sistema de administração suicida para criar mutantes de inativação da tensão do PSV DAPP-PG 722, P. agglomerans dapp-pg 734 e E. Toletana Dapp-pg 735 por recombinação homóloga como descrito anteriormente por Alexeyev (1999). Estas experiências permitiram a criação dos seguintes mutantes genómicos: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734pagi, DAPP-PG 734pag, DAPP-PG 735EO e DAPP-PG 735ETOR (Tabela 1). Todos os mutantes foram verificados por PCR usando iniciadores específicos do vetor de pknock-km e sequências de DNA genômico a montante e a jusante dos genes alvo.

Extração, visualização e quantificação AHL

as cepas de PSV, P.Agglomerans e E. Toletana foram testados pela primeira vez para a produção de AHL usando uma análise “T-Trail” em um meio sólido como descrito anteriormente por Piper et al. (1993), usando biossensores AHL (todos revisados por Steindler e Venturi, 2007). A. TUMEFACIENS NTL4 (PZLR4), C. ViOaceum Cvo26, E. Coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) e Pseudomonas F117 (PASC8) em Placas Gelado de Luria – Bertani.

Os AHLs foram purificado a partir do sobrenadante esgotado e separado, utilizando uma placa de cromatografia de camada fina (CCM) para cromatografia de fase reversa em C18, conforme descrito anteriormente por Shaw et al. (1997). Para a visualização no CCM, a placa foi coberta com uma fina camada de cima de cima AB Gelled com A. TOMEFACIENS NTL4 (PZLR4) na presença de 100 μg de ML – 1 de X-Gal como anteriormente descrito por Shaw et al. (1997) ou com o ágar de Luria Superior – Bertani semeado com C. Vicaceu CVO26 (McClean et al., 1997).

Detecção de AHL e identificação por cromatografia de fase líquida de alto desempenho e MS

Os AHLs produzidos pela PSV, E. Toletana e P. Agglomerans foram identificados por LC / MS / espectrometria de massa (MS) em uma experiência de monitoramento multi-reação como descrito anteriormente por Gould et al. (2006). A vigilância foi realizada na transição do íon pai para os picos dos grupos acilo e lactona. Os picos foram comparados a padrões conhecidos e também avaliados pela análise do tempo de retenção cromatográfica. Um volume de 200 ml de sobrenadantes de cultura acelular foi extraído utilizando o mesmo volume de acetato de etilo, após a adição de 0, 1% de ácido acético. As fases orgânicas foram separadas e secas sob um capô químico. As amostras extraídas para LC / MS / MS foram ressuspensas em 100 μl de acetonitrilo, filtradas em um filtro de 0, 2 μm (Millex LCR4, Millipore, Billerica, Ma, EUA) e diluído a 300 μl com água de milho contendo 0, 1 % ácido trifluoroacético. Um volume de 100 μl desta solução foi injetado em um GEMINI C 18 de 2, 0 mm por 150 mm (fenomenex, torrance, ca, EUA) operando a uma taxa de 200 μl min -1, o efluente. Fluindo diretamente para o espectrômetro de massa. O solvente foi composto de água contendo 0,05% de ácido trifluoroacético e solvente B incluiu acetonitrilo contendo 0, 05% de ácido trifluoroacético. A coluna foi equilibrada em 20% B durante 15 min, a amostra injetada e a coluna foram lavadas por mais de 15 minutos. Uma eluição de gradiente de 20% B a 95% B em 40 minutos foi então usada para a separação de AHLs e a coluna foi finalmente lavada a 95% B durante 10 minutos antes do reequilíbrio.

Testes de motilidade, treinamento de biofilme , PRODUÇÃO DE EPS, IAA e Stoelophores, Lipase e Protease Atividades

Atividades proteolíticas e lipolíticas, enxame e natação foram determinadas como previamente indicado Huber et al. (2001). O método utilizado para detectar os senophores foi adaptado da dosagem de ágar de ágar de ágar crómio-Azurol-S (Schwyn e Neiland, 1987), anteriormente descrito por Caballero-Mellado et al. (2007). A produção de IAA por bactérias foi medida utilizando uma dosagem cor como anteriormente descrita por Gordon e Weber (1951) e Vasantthakumar e McManus (2004).

A análise da produção de exoploysaccaride (EPS) de P. Agglomerans e E. Toletana foi testado em um reis médio (b), enquanto o PSV foi testado em um médio de manitol sólido mínimo (mm) (0) (0), 2% extrato de levedura, 2% de manitol, 1, 5, %). % agar). Cepas bacterianas foram cultivadas em caixas de Luria – Bertani, riscadas para dar colônias individuais e cultivadas a 28 ° C durante 24 horas. As colônias simples foram então estriadas em KB ou MM Agar e cultivados por 48 horas a 28 ° C. Colônias que produzem EPs têm uma aparência de mucoide fluida, enquanto aquelas com um EPS deficiente têm uma morfologia não-mucoidal separada. E cremoso.

Experimentos em Planta

Todos nos experimentos da Planta foram realizados em plantas oliveiras (CV. Frantoio) envelhecido um ano. Para preparar as inoculos, as bactérias foram cultivadas em NA (agar de nutrientes) a 28 ° C durante 48 horas, suspensas em água desionizada estéril e ajustadas por espectrofotometria a cerca de 2 x 10 8 CFU ML -1. Para inoculações, 10 μl da suspensão bacteriana contendo 10 CFU mL -1 ou água (para plantas de controle) foram colocadas em feridas (3 a 5 por planta) feitas na casca de azeitona com um bisturi estéreiro anteriormente por Moretti et al. (2008).As feridas de plantas e testemunhas inoculares foram protegidas com parafilm m (American National Can, Chicago, IL, EUA). As plantas foram realizadas em caixas transparentes de policarbonato para atingir alta umidade relativa (90-100%) e mantidas em uma câmara de crescimento a 22-24 ° C, com uma iluminação de 70 μE M -2 s. -1 e um período de luz de 12 h.

No primeiro experimento na Planta, foi verificado se o sistema PSI / R AHL foi envolvido em patogenicidade e virulência. A tensão dos pais do PSP DAPP-PG 722 e os mutantes de ponta de PPSI e PPSR foram inoculados em oliveiras e a gravidade da doença foi avaliada após 60 dias medindo a profundidade de proliferação de tecidos usando a proliferação de tecidos usando “uma cena vernier.

No segundo experimento, o efeito da co-inoculação de oliveiras com VGV ou os respectivos mutantes de AHL QS e E. Toletana ou P. Agglomerans foram avaliados, bem como seus respectivos mutantes de AHL Qs, sobre a gravidade da doença e crescimento bacteriano nas plantas. após a inoculação. Para co-inoculação, as duas suspensões bacterianas foram mistas (proporção 1: 1) para obter uma concentração final de 10 CFU ML -1. A gravidade da doença foi registrada determinando o volume dos nós, calculados medindo o comprimento, a largura e a profundidade (subtraindo o diâmetro da haste medidos acima do nó daquele medido abaixo do nó) do nó para l Ajuda com um venier (Moretti et al., 2008). Para a determinação do crescimento bacteriano, o tecido correspondente ao local de inoculação foi extirpado e homogeneizado pela ruptura mecânica. As diluições seriais das suspensões bacterianas resultantes foram disseminadas sobre as placas de NA e incubadas a 27 ± 1 ° C. As contagens de colônias foram realizadas após 24 e 48 horas de incubação. As colônias de VGV foram facilmente distinguidas daquelas de E. Toletana e P. Agglomerans. As colônias do VGV, cujo crescimento era mais lento do que o de E. Toletana e P. Agglomerans, eram pequenos, brancos, com um centro ligeiramente elevado e uma borda plana e ondulada transparente. As colônias de E. Toletana eram não-pigmentadas, circulares, convexas, zumbidos inteiros, fluidos translúcidos e muito mucoides (apenas tipo selvagem). As colônias de P. Agglomerans eram amarelas, circulares, ligeiramente convexas, com borda irregular, com superfície mais ou menos enrugada, fluido translúcido e muito mucoide (apenas tipo selvagem).

na terceira e quarta experiências, O efeito da co-inoculação de azeitona com VGV e E. Toletana no crescimento bacteriano foi avaliado 3, 8, 15, 30 e 60 dias após a inoculação (IPR), conforme descrito na segunda experiência. Três plantas replicadas para cada nível de tratamento ((1) PSV, (2) E. Toletana, (3) PSV + E. Toletana) foram incluídos em cada experimento. Para cada planta, as inoculos foram colocadas em três feridas feitas em três posições diferentes: basal (cerca de 20 cm acima do solo), intermediário e apical.

Análises estatísticas

os dados de O primeiro e o segundo em experimentos da Planta foram submetidos a uma análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de multi-praias Duncan, usando o software Dsaastat V. 1.1 (ONOFRI, 2007).

Os dados do terceiro e quarto em experimentos da UNTA foram transformados em logaritmos básicos (para corrigir heteroestasticidade) e foram usados para definir um modelo misto linear (Garrett et al. , 2004, Onofri, 2010) descrevendo a relação entre o número de células bacterianas e a raíze quadrada do tempo (para cada estirpe / grupo) por meio de funções polinomiais da segunda ordem. Análises preliminares mostraram que o efeito da posição de inoculação (basal, intermediário e apical) não foi significativo e, portanto, a posição da planta e inoculação na planta foi adicionada ao modelo como efeitos aleatórios, a fim de ter em conta o dados. A estimativa dos parâmetros foi feita pela máxima probabilidade, conforme implementado no pacote NLME no ambiente estatístico R (Venables e Ripley, 2002). Diferenças entre cepas / grupos em termos de crescimento cinética foram avaliadas usando testes de verossimilhança.

Números de acesso de sequência de DNA e nucleotídeos

Todas as seqüências de DNA foram realizadas no Centro de CRIBI (universidade de Pádua, Itália) ou macrógeno (www.macrogen.com) e sequências nucleotídicas foram depositadas no Genbank / Embl / DDBJ. O Locus EtOI / R QS de E. Toletana DAPP-PG 735 é depositado sob o número de acesso FN870373, enquanto o Locus PSI / R PSV é depositado sob o número de acesso FN870374.

AHL Sistemas de produção e QS de cepas P. Savastanoi, P. Agglomerans e E. Toletana

primeiro, foi interessante determinar se os residentes do patógeno do PSV e a azeitona produziu Moléculas de sinalização AHL QS. Todas as cepas que testamos (Tabela 1) produziram compostos AHL, como inicialmente detectados por teste de placa em forma de T em C. vioaceum CV026 e A. TOMEFACIENS NTL4 (PZLR4) e E. coli MT102 (PJBA132), biossensores. Por análise CCM, inicialmente atribuímos o tipo de AHLs produzidos pela PSV, P. Agglomerans e E. Toletana (Figura 1 e Tabela 2). Os resultados mostraram que todas as cepas VGV e E. Toletana produziram duas moléculas AHL identificadas por provisoriamente como sendo C6-3-Oxo-HSL e C8-3OXO-HSL (Figura 1). P. Agglomerans, por outro lado, provavelmente produziu o C4-HSL e o C6-HSL. A fim de confirmar inequivocamente os AHLs produzidos pelos três corantes, utilizamos a cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa C 18 e a espectrometria de massa, e conseguimos verificar a produção de 3-Oxo-C6-HSL e 3 -OXO -C8. -HSL por PSV e E. Toletana, e C6-HSL e C4-HSL por P. agglomerans (Figura 1 adicional).

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PSV AHL Produção isolada dos nós de azeitona e louro-cor-de-rosa, E. Toletana e P. Agglomerans. (a) CCM analisa os padrões sintéticos AHL usando o Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. (b) Análise de TLC do AHL produzido por sete cepas do PSV usando Biossensor de A. TOMEFACIENS PNTL4 como uma camada de recuperação. LANES: (1) tensão lmg 2209 t; (2) DAPP-pg 536; (3) DAPP-pg 722; (4) DAPP-pg 723; (5) DAPP-PG 725; (6) DAPP-pg 726; (7) DAPP-PG 728. (c) Análise CCM da AHL produzida por duas cepas E. Toletana usando Biossensor de PNTL4 TOMEFACIENS como camada de recuperação. LANES: (8) Stem CFBP 6631 T; (9) DAPP-PG 735. (d) Análise TLC de padrões sintéticos AHL usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. (e) Análise do CCM de AHLs produzidas por P. Agglomerans DAPP-PG 734 (Strip 1) usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; CCM, cromatografia de camada fina.

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O sistema AHL QS do PSV DAPP-PG 722 foi identificado e clonado, como Explicado em materiais e métodos, consistindo de um pares Luxi chamado PSI e um homólogo luxr chamado PSSR (Figura 2A). O sistema PSI / R tem um grau muito alto de homologia (mais de 90%) com o sistema AHLI / R AHL QS de P. Syringae, que responde ao C6-3-Oxo-HSL e está envolvido na virulência (Quinones ET al., 2005). Da mesma forma, identificamos e clonamos o sistema AHL QS de E. TOLETANA DAPP-PG 735 (veja a seção Material e Métodos) que consiste em um ponto designado por Luxi designado (Figura 2A). O sistema ETOI / R tem uma homologia significativa (cerca de 60%) com o sistema Erwinia Chrysanthemi PV EXPI / R. zeae (= dickeya zeae), que não é apenas responsável pela produção de C6-3-Oxo-HSL, mas também de sua resposta (Nasser et al., 1998, Hussa, 2008). Foi estabelecido por PCR, clonagem e sequenciamento que o sistema AHL QS de P. Agglomerans da cepa DAPP-PG 734 foi ortólogo (identidade de mais de 95%) em relação ao sistema PAGI / R de P. Agglomerans PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009).

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AHL cartões genéticos e produção por mutantes AHL QS-Knockout Azeite Isolados aninhados no PSV, E. Toletana e P. Agglomerans. (A) Mapas genólicos de PPSI / R e ETOI / R Locais clonados de PSV e E. Toletana, respectivamente. Ao ver o sistema PPSI / R, é mostrado que os genes são ortoólogos do gene PSV sequenciado NCPPB 3335. De fato, a região sequenciada aqui na tensão do DAPP-PG 722 é ortólogo daquela na tensão 3335 do NCPPB (( B) (a) Análise do CCM de padrões sintéticos AHL usando o Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. (b) Análise do CCM dos AHLs produzidos pela PSV PSV DAPP-PG 722 e derivados mutantes usando A. Biossensor PNTL4 de Tumefaciens como uma camada de recuperação. psi – é dopp-pg 722ssii; PSSR – é o DAPP-PG 722SSII. c) Análise do CCM de AHLs produzidas pela estirpe matriz E. Toletana Dapp-pg 735 e derivados mutantes utilizando a Biossensor de PNTL4 TOMEFACIENS como uma camada de recuperação. TOLI- é DAPP-PG 735TOLI; TOLR- é DAPP-PG 735TOLR. d) Análise TLC de normas sintéticas AHL utilizando Biosensor CV026 de C.Vioaceum como uma camada de recuperação. (e) Análise do CCM de AHLs produzidas pela estirpe materna de P. agglomerans DAPP-PG 734 e derivados mutantes usando o Biosensor C. ViOaceum CV026 como uma camada de recuperação. Pagi – é dopp-pg 734pagi; PAGRA – é o DAPP-PG 734PAGR. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; Qs, detecção de quórum; Savastanoi; CCM, cromatografia de camada fina.

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Os mutantes de knvout de PSV, P. Agglomerans e E. Toletana foram gerados tanto nos genes QS Luxi – quanto Luxr – como descrito na seção Material e Métodos. Nenhum dos mutantes da família luxífera das três espécies (DAPP-PG 722SSI, DAPP-pg 734pagi e DAPP-PG 738ETOI; Tabela 1) produziu níveis detectáveis de AHL quando foi purificado de sobrenadantes gastos (Figura 2B). Este resultado indica que as três espécies provavelmente têm apenas um sistema AHL QS; Para a VGV, esta conclusão é corroborada pelo fato de que apenas um par da família Luxi / R está presente em seu genoma, que foi recentemente sequenciado (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010). Os mutantes da família Luxr, por outro lado (DAPP-PG 722PSR, DAPP-PG 734pag e DAPP-PG 738ETOR; Tabela 1) produziram quantidades de AHL semelhantes às produzidas pelo tipo selvagem (Figura 2B), Indica em três sistemas, não houve loop de amplificação de sinal através da regulamentação do gene da família Luxi. Estas conclusões são baseadas na análise CCM de extratos de sobrenadantes esgotados de quantidades iguais de cultura na mesma fase crescente. Esta é uma indicação muito boa, mas as medições realizadas em toda a fase de crescimento provavelmente confirmariam essa conclusão mais.

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Qs no PSV regula a virulência em plantas

para examinar Se o sistema PSV PSA / R AHL está envolvido em patogenicidade e virulência, os mutantes da PSV DAPP-PG 722 e os mutantes derivados de PPSI e PPSR foram avaliados, e a gravidade da doença foi avaliada. Depois de 60 dias. Os resultados mostrados claramente que as mutações no PSI e PSSR reduzem significativamente o tamanho dos nós e, portanto, a virulência dos mutantes (Figura 3a). A profundidade dos nós foi significativamente reduzida (p = 0, 01) nas hastes inoculadas com os mutantes DAPP-PG 722SSSSS e DAPP-PG 722PSRS em relação aos inoculados com o tipo selvagem mostrando respectivas reduções de cerca de 80% e 88% (Figura 3B). ) Foi importante, por conseguinte, foi concluído, ao nosso conhecimento, que tinha sido encontrado que, pela primeira vez, a AHL QS desempenhou um papel central na virulência do PSV.

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Papel do QS AHL na formação de nós de oliveira induzidos pelo PSV. (a) as hastes de oliveiras envelhecidas em um ano (cv. fritoio) foram inoculadas com 108 mutantes derivados da CFU ML- 1 PSV DAPP-PG 722 (tipo selvagem: WT), PSSI – e PSSR – e com plantas de controle. Os sintomas da doença foram observados 60 dias após a inoculação. Grandes nós elevados foram observados nas hastes inoculadas com DAPP-PG 722 (tipo selvagem). Os mutantes do déficit na AHL QS PSI – e a PSSR – induziu apenas a proliferação celular limitada, que permaneceu limitada às bordas da ferida. (b) O tamanho dos nós foi estimado medindo a profundidade de proliferação tecidual em cinco plantas para cada tratamento e para três nós por planta. Diferenças estatisticamente significantes nos nós entre o tipo selvagem e os mutantes QS foram determinados pela análise de variância. Cada valor é a média de cinco repetições ± desvio padrão. As médias não são significativamente diferentes (p = 0, 01), dependendo do múltiplo teste de Duncan. AHL, lactona acil homoserina; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; Qs, detecção de quórum; Savastanoi.

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PSV AHL Sinthase mutantes pode ser salvo pela presença de E. Toletana e parcialmente por P. agglomerans

a presença de . Toletana e P. Agglomerans nos nós da oliveira podem resultar na formação de uma comunidade poli-microbiana com o patógeno do PSV. Desde E. Toletana e P. Agglomerans produzem AHLs e que os mutantes de PSV de AHL negativo têm uma virulência muito baixa (ver acima), isso permite que uma configuração elegante estabeleça se os sinais da AHL são compartilhados e se as comunidades intersecídicas forem formadas no Nó Olivier. .

Como E. Toletana produz estruturalmente o mesmo AHL como PSV (veja acima), uma co-inoculação na Planta foi inicialmente colocada no lugar. O mutante PSI AHL sintase foi utilizado para a co-infecção de plantas de oliveira com E. Toletana Damp-.Tensão do tipo selvagem PG 735. Esta co-inoculação permitiu que o mutante PPSI do PSV induza a formação de nós, bem como a tensão do tipo selvagem (Figura 4). Isso pode ser atribuído às duas cepas formando um consórcio, onde E. Toletana fornece aos AHLs no DAPP-PG 722SSIS, que é então capaz de induzir a expressão do gene alvo do AHL QS resultando na formação de nós. D ‘olive. As inoculações semelhantes em pares também foram realizadas com o tipo selvagem DAPP-PG 734 de P. Agglomerans e, neste caso, uma restauração parcial da formação de nós foi observada (Figura 4). Isso pode ser devido ao fato de que P. agglomerans produz diferentes AHLs de PSV, ao qual o sistema PSI / R provavelmente respondeu com menos eficiência. Importância, emparelhamento em inoculações da Planta com a E. Toletana ou a P. Agglomerans AHL Sinthase Mutant, EtOi Gold Pagi, respenutivamente, não restaurou o treinamento de oliveiro. Isso é claramente índices que a comunicação interspecial através da partilha de AHLs foi fundamental nas experiências de co-inoculação anteriores, onde os mutantes do PSV AHL Sinthase foram co-inoculados de forma independente com as duas cepas do tipo selvagem (Figura 4).

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Efeito da co-inoculação de plantas de oliveira (CV. Fritoio) com PSV e E. Toletana, P. Agglomerans e os respectivos mutantes AHL QS. PSV: As colunas indicam efeito sobre a gravidade da doença, expressa como volume de nó (60 dias após a inoculação), de inoculação do PSV WT (colunas chocadas), de mutantes com deficiência de QS de PSV (colunas brancas representam PSI Mutant e colunas pretas PSSR Mutantes) sozinho ouro em combinação com P. agglomerans (pag) ou E. Toletana (e) e relativos mutantes qs-ímpares, pagi, Prag, Etoi e Etor. As plantas de controle de azeitona foram inoculadas com a água Distille (coluna cinza). Cada valor é a média de cinco replicações ± sexo seguido pelas mesmas letras não são estatisticamente diferentes em p = 0,05 (teste de vários intervalos de Duncan). AHL, lactona de homosserina acilo; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, sensor de quorum.

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O pss PSSR mutante coud não ser concluído para o treinamento de nó de azeitona por E. Toletana e P. Agglomerans; A razão mais provável é que o Mutante PPSR PSV não pode responder aos AHLs. Estes resultados também indicam que E. Toletana e P. AGGLOMERS TIPOS selvagens não podem causar doenças sozinhas na ausência de PSV do tipo selvagem. Importa, em todas as experiências de co-inoculação, quantidades comparáveis de unidades de formação de colônias do PSV (CFU) estavam presentes no local de inoculação (Figura 5).

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Efeito sobre os níveis de co-inoculação de usinas de oliveira (CV. Frantoio) com PSV e E. Toletana, P. Agglomerans e os respectivos mutantes AHL QS. PSV: As colunas negras indicam efeito sobre o crescimento bacteriano na Planta (60 dias após a inoculação) de inoculação dos mutantes prejudicados QS da PSV da mesma bactéria psi (colunas brancas) ouro PSSR (colunas chocadas) sozinho ouro em combinação com p . Agglomerans (pag) ou E. Toletana (e) e relativos Mutantes qs-ímpares, pagi, Prag, ETI e ETR. Cada valor é a média de cinco replicações ± sexo seguido pelas mesmas letras não são estatisticamente diferentes em p = 0,05 (teste de vários intervalos de Duncan). PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi.

Concluiu-se que ambos E. Toletana e P. Agglomerans podem formar comunidades de interspecias estáveis com a VGV e que a comunicação através da partilha de sinais da AHL estava ocorrendo em Planta.

Papel do interspecial de sinalização e consórcios em pares na doença de oliva

como evidente a partir dos resultados descritos acima, a PSV forma comunidades bacterianas com E. Toletana e P. Agglomerans. A fim de começar a compreender o papel e o resultado das possendas entre estas três espécies bacterianas, a virulência da VGV na presença das outras bactérias de Olive Knot-Knot foi testada na Planta. As plantas oliveiras de um ano foram inoculadas para cada tensão bacteriana com 10 μl de uma suspensão bacteriana 10 8 CFU ML -1. Como mostrado na Figura 4, a melhoria significativa da virulência da PSV na presença de E. Toletana foi observada como indicado por um aumento considerável (quase 30%) do volume de nó. Isso indica que E. Toletana contribui para a patogenicidade do PSV; O aumento da virulência não foi devido a mudanças nos níveis de PSV na co-inoculação como costa foi diferença significativa na carga bacteriana (Figura 5). A mesma contribuição para a virulência do PSV foi observada quando co-inocular com a sintase mutante de E. toletana AHL; Não se pode exclusivo, no entanto, que os sinais do PSV AHL são percebidos por E. Toletana. Nenhum aumento na virulência, por outro lado, foi observado quando P.Agglomerans foi co-inoculado com a VGV e, de fato, uma ligeira diminuição do volume do nó era observar. Quando co-inocular com o p. AGLOMERANS AHL sintase mutante, no entanto, tem um aumento significativo na formação de volume do nó foi detectada, o que significa que Qs regula algum fator (s) em P. agglomerans, que limitam o crescimento do PSV e / ou expressão gênica.

Após os resultados óbvios na natureza poli-bacteriana da doença e na partilha de sinais AHL entre o PSV e E. Toletana, foi interessante entender melhor essa comunidade bacteriana. O impacto da co-inoculação sobre a dinâmica de crescimento dessas bactérias tem sido determinado em dois experimentos distintos. Como os resultados desses experimentos são semelhantes, somente os dados de um dos experimentos foram relatados. Por conseguinte, a co-inoculação foram realizadas e as populações bacterianas foram determinadas até 60 dpi. Quando o PSV DAPP-PG 722 foi inoculado sozinho, um aumento de 10 vezes poderia ser detectado na população bacteriana isolada de 8 dpi tecido inoculado (cerca de 10 7 CFU por site) (Figura 6A, círculos vazios). A população PSV aumentou gradualmente para cerca de 1, 5 × 10 8 CFU por site a 60 dpi. Quando foi realizada uma inoculação mista com E. Toletana DAPP-PG 735 (Figura 6A, Círculo Completo), o crescimento do VGV foi significativamente aumentado (teste da razão de verossimilhança com p < 0 0001), enquanto quando E. Toletana foi inoculado sozinho no tamanho de suas populações (Figura 6b, triângulo aberto). Por outro lado, o crescimento de E. Toletana não poderia ser adequadamente descrito usando um modelo polinomial de segunda ordem, mas tem sido estimulado significativamente para 30 dpi (o erro de diferença padrão foi de 0, 018) na presença de PSV (Figura 1). 6b, triângulo completo), e após 60 dpi, o tamanho da população resultante da infecção mista foi de cerca de 103 vezes maior do que o obtido por simples inoculações. Estes resultados são uma indicação adicional da relação íntima e mútua entre a VGV e E. Toletana no nó oliva, resultando em um agravamento de sintomas de doenças, a partilha de sinais AHL QS e um aumento do crescimento bacteriano. De ambas as espécies.

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As populações de pessoas dinâmicas do DAPP-PG 722 e E. Toletana Dapp-pg 735 inoculado em hastes oliveiras (CV. Fritoio), sozinho ou em combinação. (a) Crescimento do PSV sozinho (linha contínua e círculo aberto) ou em combinação com E. Toletana (linha pontilhada e círculo preenchido). (b) Crescimento de E. Toletana sozinho (linha completa e triângulo aberto) ou em combinação com VGV (pontilhada e triângulo total). Os símbolos indicam as contas observadas e as linhas indicam o ajuste do modelo misto linear. O erro típico de uma média foi 0, 013.

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Teste de regulamento dependente AHL de vários fenótipos em P. Savastanoi, p. Agglomerans e E. Toletana

Para estabelecer o papel possível dos sistemas AHL QS em bactérias associadas a nós de oliveira, vários fenótipos importantes foram testados para a regulamentação do AHL Qs nas três espécies. Uma lista de todos os fenótipos testados para o regulamento AHL QS é resumida na Tabela 2.

Curiosamente, decidimos que P. Agglomerans Dapp-Pg 734 e E. Toletana Dapp-pg 735 também produzem IAA. Testamos os tipos selvagens PSV (DAPP-PG 722), P. Agglomerans (DAPP-PG 734), E. Toletana (DAPP-PG 735) e seus mutantes derivativos (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SSR, DAPPP 734Pagi, DAPP-PG 734PAGR, DAPP-PG 735ETO e DAPP-PG 735ET) para a produção de IAA. Da mesma forma, nós verificamos se AHL QS estivesse envolvido na produção de senopapores, a produção de EPS, as atividades proteolíticas e lipolíticas secretadas e a motilidade por natação e enxame. Os resultados dessas investigações são resumidos na Tabela 2. Surpreendentemente, na maioria dos testes, não foram observadas diferenças significativas entre as cepas de motores e seus derivados QS mutantes nas condições testadas. A produção de PES foi testada qualitativamente em um teste de placa em todas as cepas selvagens e mutantes. Os dois mutantes AHL Qs da tensão PSV DAPP-PG 722 apresentaram uma clara redução na produção de PES em relação ao tipo selvagem (dados não apresentados); A produção de PES foi restaurada quando o Mutant DAPP-PG 722PSI foi cultivado na presença de C6-3-OXO ou C8-3OXO-HSL (não renome). Da mesma forma, para P.Agglomerans, a inativação do pagi resultou em uma redução na produção de PES; No entanto, nenhuma redução foi observada no Mutant PraGR em relação ao tipo selvagem. A produção de EPS foi restaurada quando o mutante DAPP-PG 734PAGI foi cultivado na presença de C4-HSL ou C6-HSL (dados não apresentados). A produção de EPS também foi reduzida no mutante E. Toletana Dapp-pg 735eto em relação à do tipo selvagem, e a complementação por adição exógena C6-3-Oxo-HSL ou C8-3OXO-HSL restaurou a produção de EPS . No entanto, na E. Toletana, a inativação da etch aumentou consideravelmente a produção de PES (dados não apresentados).

discussão

até à data, muitos estudos mostraram que o As doenças das plantas resultaram de interações complexas entre o patógeno e o anfitrião. A interação do patógeno com a flora bacteriana residente é muito menos estudada e compreendida. As bactérias fitopatogênicas formam comunidades bacterianas estáveis com outras bactérias residentes não patogênicas? Essas redes de associação são na origem de uma infecção multi-microbiana? A sinalização intercelular tem um papel a desempenhar no estabelecimento desses consórcios bacterianos? Estas são as perguntas que começamos a abordar aqui usando a comunidade bacteriana presente na doença do nó de oliva. Este nicho é criado pelo patógeno do PSV; No entanto, várias outras espécies bacterianas residentes não patogênicas foram isoladas nesse ambiente, na maioria das vezes E. Toletana (Rojas et al., 2004) e P. Agglomerans (Marchi et al., 2006). As principais conclusões deste trabalho são que (i) as três espécies isoladas do nó Olivier produzem sinais de AHL e têm um sistema AHL QS; Em particular, E. Toletana e PSV produzem os mesmos AHLs, (ii) AHL Qs em PSV é essencial para a virulência, porque os mutantes de eliminação são fundamentalmente não virulentos, (iii) PSV Os mutantes da AHL Sintase podem ser salvos por e. Toletana e Parcialmente por P. Agglomerans, destacando a partilha de sinais de AHL e a formação de comunidades bacterianas estáveis, e (iv) E. Toletana forma comunidades na fábrica, atuando como patógeno associado em sinergia com o patógeno principal do PSV, aumentando as co-inoculações o número de bactérias de ambas as espécies e a gravidade da doença. Todos os mutantes bacterianos construídos neste estudo foram produzidos durante eventos homólogos de recombinação e também envolvem inserções plasmídeas. Portanto, é possível que nossos experimentos realizados em plantas sem seleção de antibióticos levem a um retorno de mutantes para o tipo selvagem. Como todas as experiências de supervisão de nosso estudo não levaram ao comportamento do tipo selvagem, concluímos que nenhum feedback significativo ocorreu.

Atualmente, os únicos determinantes moleculares conhecidos pelo desenvolvimento do desenvolvimento do nó em O PSV é o sistema de secreção do tipo III (Sisto et al., 2004) e phytohormones de citocinina e IAA (Suico et al., 1985, vidro e Kosuge, 1988, Rodriguez-Moreno et al., 2008). Ahl Qs agora pode ser adicionado a esta lista e, ao nosso conhecimento, é o primeiro sistema regulatório ligado à viulência do PSV. Ahl Qs provavelmente não afetará a colonização inicial, mas sim a expressão genética da virulência associada a altas densidades populacionais. Seria agora relevante determinar se a AHL QS está envolvida na regulação dos três determinantes da virulência identificada até à data. Muito provavelmente, ahl Qs também regula muitos outros fatores de virulência. O recente sequenciamento do genoma do PSV destacou a presença de muitos loci que podem ser envolvidos na virulência, incluindo cinco sistemas de secreção diferentes, efeitos do tipo III, compostos fenólicos, quimiotaxis, motilidade, l de adesão e genes de toxina (Rodriguez-Palenzuela). et al., 2010). Nós relatamos que a produção de PES é regulada pelo sistema PSV PSC / R; No entanto, não está claro se o EPS está envolvido no processo da doença. O SPE, por exemplo, é um fator de virulência e é regulado pelo AHL QS. Está intimamente relacionado a P. Syringee (Quinones et al., 2005).

A vida de bactérias dentro do nó é desconhecida no sentido amplo. Um estudo recente, no entanto, mostrou que a VGV cria o nó formando agregados bacterianos, micococonia e biofilmes multicamadas (Rodriguez-Moreno et al., 2009, Perez-Martinez et al., 2010). Sabemos pouco sobre os efeitos de P. agglomerans e E.Toletana sobre o desenvolvimento de nós e a possível formação e estabilidade de consórcios bacterianos multipecíficos formados no nó de oliva. P. Agglomerans é generalizada em muitos habitats naturais e agrícolas; Em particular, está associado a muitas plantas como epifyte e endophyte (Lindow e Brandl, 2003). Além disso, a P. Agglomerans pode ser convertida em um patógeno tumorigênico específico do hospedeiro, uma bactéria comensal e epífita associada a muitas plantas, adquirindo uma ilha de patogenicidade transmitida por um plasmídeo (Barash e Manulis-Sasson, 2007).

Os AHLs produzidos por E. Toletana (C6-3-Oxo-HSL e C8-3OXO-HSL) são os mesmos que os produzidos pela PSV. Esta é a prova de que pode haver sinalização intersecífica através do AHL entre as duas espécies quando ocupam o mesmo nicho. P. Agglomerans, por outro lado, produz C4-HSL e C6-HSL; Não podemos excluir que o PSSR e / ou o Etor são capazes de responder a esses AHLs. Da mesma forma, não sabemos se Pragg também pode responder a AHLs produzidos por E. Toletana e PSV. Nossos estudos envolvendo co-inoculação binária na Planta mostraram que E. Toletana pode salvar os mutantes PSV AHL sintase para sua capacidade de induzir nós de oliveira. Como os sintomas colocam pelo menos 25 a 30 dias para crescer, esse resultado sugere isso. Toletana e PSV são capazes de formar um consórcio estável, onde as duas espécies sofrem sinalização interspecífica e um AHL de compartilhamento. P. Agglomerans também pode economizar, em parte, o Mutant PPSI do PSV; A razão para este resgate parcial é que os AHLs produzidos por P. agglomerans não são bem reconhecidos pelo PSSR, ou que o consórcio não é tão estável quanto para E. Toletana. É possível que nesse nicho, que permita que tal consórcio cresça, incentivar a aparência de treches bacterianos de fraude (por exemplo, os trechos cegos do sinal, que não respondem aos sinais AHL), que não contribuem para A comunidade pode se beneficiar de “fatores” ou “bens públicos” produzidos pelos cooperadores QS (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Muitos outros isolados bacterianos devem ser isolados desse nicho para determinar essa possibilidade.

A capacidade do PSV para induzir a formação de nós de oliveira é baseada em sua capacidade de regular a expressão dos genes em resposta. Para o Ambiente do Host. Também começamos a nos perguntar se a microflora avorentulenta aborígene contribui para a doença causada pelo PSV. A co-inoculação de E. Toletana com VGV resultou em um aumento significativo no volume de nós de oliveira, indicando que esse consórcio é provavelmente muito estável e que a PSV se beneficia da presença de E. Toletana e talvez até o inverso. Também é importante notar que os estudos de co-inoculação determinaram que E. Toletana e vice-versa estimularam significativamente o crescimento do PSV no nó oliva, que indica uma associação estreita entre o metabolismo, nutrientes e sinal. Entre as duas espécies bacterianas. Este efeito sinérgico de E. Toletana com P. Savastanoi indica claramente uma vantagem mútua para ambas as espécies se crescerem e compartilhar o mesmo nicho. Compreender os mecanismos de cooperação e comunicação dessas duas bactérias iluminarão o processo de comunicação interspecífica. E. Toletana não é patogênica quando é inoculado com o Mutant PSSR do AHL QS PSV, mas pode servir como um patógeno acessório quando é consórcio com PSV do tipo selvagem. É possível que a expressão dos genes do PSV possa ser influenciada pela presença de residentes bacterianos ou o consórcio microbiano estabiliza o PSV metabolicamente. A co-inoculação de P. agglomerans com VGV, por outro lado, resultou em uma redução no volume do nó, que aumentou quando o co-inoculante era o pagi do Mutant AHL Synthase. P. Aglomerans é mais provável que produza e AHL QS regula o fator, que afeta a VGV, e quando a produção é reduzida, P. agglomerans também pode atuar como um patógeno acessório.

Há muito. Poucos relatórios sobre a contribuição / papel da flora microbiana aborígene residente do hospedeiro na ação de um patógeno recebido. É interessante notar que, em 1998, foi relatado que na rizosfera do trigo, há uma interagência de espécies bacterianas que possivelmente podem compartilhar moléculas de AHL (Pierson et al., 1998). Dois estudos recentes mostraram que a microflora indígena teve influência sobre a virulência de P. aeruginosa e que também afeta os perfis de expressão genética dos fatores associados à virulência (Duan et al., 2003, 2003). .Atualmente não está claro se há compartilhamento de sinal entre essas bactérias; Observou-se que o sinal da AI (Autoinutor) -2 produz tanto as bactérias do grama positivo quanto o Gram negativo podem ser um sinal intersecífico nesta comunidade (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). É interessante notar que Dulla e Lindow (2009) relataram muito recentemente que as bactérias epifíticas indígenas produzem a mesma p. syringae p. Syringae pode excluir e interferir no processo causando a doença. Este trabalho destacou um diálogo cruzado na fitafera da fábrica através da AHL, que resultou em mudanças no comportamento (principalmente motilidade, o que significa menos invasão) e, portanto, a virulência de P. Syringee PV. Syringae. A ocorrência da doença durante a co-inoculação com bactérias epífitas produtoras de AHL foi reduzida em 50%. Acredita-se que isso se deve à indução prematura e prematura de AHL Qs afetando a expressão dos fatores associados à virulência. Este exemplo mostra que a comunicação interspecífica com flora bacteriana indígena também pode ter consequências negativas para agentes fitopatogênicos.

Os dados apresentados aqui reforçam ainda mais a aparente complexidade de infecções poli-microbiais; Nossos resultados indicam um papel de compartilhar a AHL e a sinalização interspecífica, que fornece um excelente modelo de trabalho para aprofundar as interações entre as comunidades bacterianas. Este estudo concentra-se nas interações medidas por AHL em habitats naturais; Até agora, o papel do QS nas bactérias associados a plantas foi estudado quase exclusivamente com cepas únicas, apesar da possibilidade de sinalização interspecífica que pode ser mediada pelo compartilhamento de moléculas de sinal AHL em comunidades misturadas microbianos. As interações entre as bactérias do ambiente natural são complicadas por vários fatores, incluindo a resposta do hospedeiro, os parâmetros ambientais e a composição específica da comunidade. Sugere-se que estudos futuros precisarem desenvolver sistemas in vitro para uma compreensão prática e detalhada das interações de espécies. Acabamos de começar a desenvolver ferramentas para estudar interações microbianas no ambiente natural.

Nossos estudos futuros se concentrarão na estabilidade e do papel desempenhado por cada espécie neste consórcio microbiano. O PSV pode ser considerado como o nicho criador ou o líder deste consórcio, enquanto P. agglomerans e E. Toletana são ocupantes ou moradores de nicho, que podem, no entanto, se tornarem patógenos auxiliares na presença de um nicho do fabricante. Atualmente, não está claro se esses consórcios patogênicos têm uma razão comum. Assumimos que o consórcio dos nós de oliveira evoluiu para se tornar estável e cooperativo porque o aumento do grupo genético e o repertório metabólico combinado aumentam as chances de sobrevivência dos participantes em várias condições (Venturi et al., 2010). Este trabalho sugere que os processos de comunicação complexos entre espécies podem ser necessários para a formação desses consórcios.

Genbank / Embl / DDBJ

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