Segnali di condivisione Rilevamento del quorum e ruolo delle comunità interspecifiche in una malattia batterica delle piante

Soggetti

  • Patogenesi batterica
  • Fisiologia batterica
  • , segno di cellule
  • , ecologia microbica

astratto

batteri patogeni interagiscono non solo con l organismo ospite, ma Molto probabilmente con la flora microbica residente. Nella malattia dei nodi d’ulivo (Olea Europaea), l’agente coinvolto è il pseudomonas Savastanoi PV Batteri. Savastanoi (PSV). Due specie batteriche, ovvero agglomerans a Pantoa e Erwinia Toletana, che non sono patogeni e che sono epifite e endofiti dell’olivo, sono state molto spesso associate al nodo dell’olivo. Abbiamo identificato i segnali chimici prodotti dai ceppi delle tre specie isolate del nodo oliva e hanno scoperto che appartenevano alla famiglia dei segnali QS del lattone di n -yl-omoseerine. I geni della famiglia luxi / r responsabili della produzione e della risposta a questi segnali nelle tre specie batteriche sono stati identificati e caratterizzati. La mutagenesi per inattivazione e esperienze genomiche sulle piante hanno dimostrato che la virulenza di PSV dipende in modo critico dal QS; Tuttavia, la mancanza di produzione del segnale può essere completata da E. Toletana o P. Agglomerans del tipo selvaggio. Sembra anche che la malattia causata da PSV sia aggravata dalla presenza delle altre due specie batteriche. In questo articolo, discutiamo del ruolo potenziale del sistema di controllo della qualità nello stabilire un consorzio stabile che conduce a una malattia poli-batterica.

Introduzione

Le malattie batteriche risultano dalla capacità dei patogeni colonizzare e regolare l’espressione dei geni in risposta all’ambiente ospitante. Di conseguenza, la maggior parte degli studi fino ad oggi è stata centrata sulle interazioni molecolari tra l’host e i batteri. Ci sono interazioni tra l’agente patogeno e altri batteri che occupano la stessa nicchia (“residenti”)? Ad esempio, sibley et al. (2008) hanno recentemente dimostrato che c’erano interspecifiche interazioni batteriche tra la pseudomonas aeruginosa patogeno umano e residenti batterici indigeni non patogeni presenti nell’host (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). Con questo lavoro, intendiamo avviare uno studio sistematico del ruolo della segnalazione interspecifica nella patogenesi batterica delle piante che utilizzano come modello la malattia del nodo oliva causato dal patogeno batterico Pseudomonas Savastanoi PV. Savastanoi (PSV).

p. Savastanoi è strettamente correlato a Pseudomonas Syringae, un fitopatologico in grado di provocare molti sintomi in diverse piante (Hirano e superiore, 2000, Hofte e il tuo, 2006). Negli ultimi anni, la comprensione dei meccanismi di virulenza di P. Syringae sulle piante erbacee è aumentata considerevolmente e anche diversi ceppi sono stati sequenziati (Feil et al., 2005, Joardar et al., 2005). D’altra parte, i progressi nella comprensione della patogenicità di P. Savastanoi sulle piante legnose erano molto lente. I ceppi di P. Savastanoi possono infettare varie specie di host legnose come l’ulivo, la cenere e l’oleandro, provocando spesso una crescita eccessiva dei tessuti infetti, causando nodi, possibilità e crescita simili alle verruche (Hirano e in alto., 2000, Kennelly et al., 1997). 2007). Diversi pathovars si distinguono in questa specie, incluso il PV. Savastanoi, PV. Fraxini e PV. Nerii causando nodi e Galles sui membri della famiglia di Oléaceae e Laurels Roses (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993).

Il PSV è l’agente responsabile della malattia del nodo di oliva Alla Olivier (Olea Europaea L.) (Gardan et al., 1992, Vivian e Mansfield, 1993, Hirano e Tomaia, 2000). Sorprendentemente, pochissimi studi molecolari sui determinanti della vilenza del PSV sono stati effettuati finora. Questi studi iniziali hanno determinato che un sistema di secrezione di tipo III e fitoormoni, acido indolo-3-acetico (IAA) e citokinins sono coinvolti nello sviluppo del nodo. (Suico et al., 1985, vetro e kosuge, 1988, Sisto et al., 2004, Rodriguez-Moreno et al., 2008).

Interessante, oltre al PSV, due altre specie batteriche Avere molto spesso associato al nodo degli ulivi, vale a dire Agglomerans Pantoa (Gavini et al., 1989, Fernandes e Marcelo, 2002, Marchi et al., 2006) ed Erwinia Tletana. (Rojas et al., 2004).Ad oggi, poche cose si conoscono sui possibili effetti sinergici e comunitari di questi enterobacteriaceae sullo sviluppo dei nodi. P. Gli agglomerani sono diffusi in molti habitat naturali e agricoli; In particolare, è associato a molte piante come Epiphyte e Embohyte (Lindow e Brandl, 2003). Può briciolare la crescita del PSV in ulivi probabilmente dalla produzione di antibiotici, o in alcuni casi aumenta anche la dimensione dei nodi (Marchi et al., 2006). La loro frequente presenza e isolamento dallo stesso ambiente, dove coesistono come endofiti comuni residenti dei nodi dell’oliva, suggeriscono che le interazioni, la formazione di comunità e sinergie potrebbero verificarsi. La comunità batterica del nodo oliva è quindi una nicchia speciale per studiare il ruolo della comunicazione interspecifica e dell’interazione della Comunità tra il patogeno e il batterio residente nello sviluppo della malattia.

una cella cellulare Meccanismo di segnalazione, noto per svolgere un ruolo importante nella virulenza dei batteri fitopatologeni, è il sistema di comunicazione intercellulare del quorum rilevante (QS) (von Bodman et al., 2003). QS regola l’espressione dei geni in risposta alla densità cellulare attraverso la produzione e il rilevamento di molecole di segnale (per riviste, vedere i riferimenti Basser (2002) e Fuqua e Greenberg (2002)). Nei batteri gram negativi, le molecole di segnale più comuni sono lattones n-acil omoseerine (AHL), che sono prodotte da un lattone sintasi Acil Slousin nella maggior parte dei casi della famiglia Luxi Protein. Un regolatore trascrizionale / di trascrizione appartenente alla famiglia LUXR costituisce quindi un complesso con gli AHLS relativi alle concentrazioni di soglia (“quorum”) che colpiscono così la trascrizione dei geni bersaglio (Fuqua. Et al., 2001). I batteri della natura crescono principalmente sotto forma di consorzi poli-microbici, che molto probabilmente implicano la segnalazione interspecifica dall’azione di molecole di segnale diffusibili (Ryan e Dow, 2008, Duan et al., 2009). La comprensione della segnalazione continua nelle comunità poli-batteriche sarà una sfida per gli studi futuri, poiché la maggior parte delle indagini QS si sono concentrate sulle configurazioni monoculture.

Il ruolo di AHLS nella segnalazione interspecifica e la formazione delle comunità non è chiara E, almeno a nostro avviso, non è stato sufficientemente studiato. Questo lavoro dovrebbe costituire l’inizio di uno studio sistematico di questa domanda utilizzando la Comunità dei nodi di ulivo tra PSV, P. Agglomerans ed E. Toletana come sistema modello. Le tre specie producono segnali AHL e partecipano alla segnalazione inter-specie? Finora, AHL QS è considerato specifico per ogni specie / ceppo, ma non è chiaro se AHL QS ha un ruolo importante da svolgere in nicchie che coinvolge una cooperazione stabile tra diversi membri batterici. I risultati hanno dimostrato che le tre specie hanno sistemi AHL QS che producono AHL simili e in due casi, producendo lo stesso AHLS. Ahl QS è stato mostrato qui per la prima volta come essenziale per la patogenicità del PSV, perché la virulenza dei mutanti di Ahl QS-knockout è notevolmente ridotta. I co-inoculanti in coppia di ulivi con residenti di tipo selvaggio e mutanti PSV Ahl Syntase ripristinano la piena virulenza del PSV. Ciò dimostra che diverse specie possono formare consoria microbica stabile in cui AHL QS svolge un ruolo importante. Negli studi di co-inoculazione PLAANTA hanno anche dimostrato che si verificano sinergie tra le diverse specie batteriche, indicando che i nodi dell’albero di ulivo possono essere causati da una malattia poli-batterica.

ceppi batterici, plasmidi e sfondi

PSV ceppi, P. Agglomerans ed E. Toletana e plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 1. I ceppi batterici sono stati coltivati a 28 ° C in un ambiente minimo M9 aggiunta di glucosio (Sambrook et al., 1989), in King’s B Medium (King et al., 1954) o in Luria – Bertani. Sei biosensori batterici AHL sono stati utilizzati per il rilevamento di AHL: VIOACEUM Chromobacterium CVO26 Stennie (McClean et al., 1997), Agrobacterium Tumefaciens NTL4 / PZLR4 (Shaw et al., 1997), Escherichia Coli MT102 / PJBA132 (Andersen et al., 2001)., Pseudomonas Putida F117 / PASC8 e P. Putida F117 / PKRC12 (Riedel et al., 2001). I ceppi di cromobacterium, agrobacterium e pseudomonas sono stati coltivati a 30 ° C come raccomandato, mentre i ceppi del rivelatore E. coli sono stati cresciuti a 37 ° C.Antibiotici alle seguenti concentrazioni finali sono stati aggiunti secondo necessità: Ampicillin, 100 μg ML -1; Streptomicina, 100 μg ml -1; Tetracycline, 15 μg ML -1 (E. coli) o 40 μg ml -1 (pseudomonas); Gentamicina, 10 μg ML -1 -1 (E. coli), 30 μg ML -1 (Agrobacterium) e 40 μg ML -1 (pseudomonas); Kanamycin, 50 μg ml -1 (E. coli e c. viioaceum) o 100 μg ml -1 (pseudomonas, pantoa ed erwinia); Nitrofurantoin, 50 μg ml -1.

Tabella a formato full size

Tecniche del DNA ricombinante

Tecniche del DNA ricombinante, compresa la digestione all’aiuto per gli enzimi di restrizione, gel di agarosio Elettroforesi, purificazione dei frammenti del DNA, legatura con T4 Ligase, riempimento finale con l’enzima di Klenow e la trasformazione E. Coli sono stati eseguiti come descritto da Sambrook et al. (1989). I plasmidi sono stati purificati utilizzando colonne Jet Star (Genomed, Löhne, Germania); Il DNA totale di PSV, P. Agglomerans ed E. Toletana è stato isolato da Lyse Sarkosyl-PraNase come precedentemente descritto da Better et al. (1983). I giunti tripranentali tra E. coli e PSV, P. agglomerans o E. Toletana sono stati realizzati utilizzando il ceppo ausiliario E. Coli DH5 (PRK2013). Le ricerche di omologia della sequenza di DNA sono state condotte utilizzando il National Biotechnology Center Blast Database.

Clonazione e inattivazione dei geni QS a P. Savastanoi, P. Agglomerans ed E. Toletana

per PSV Dapp- PG 722 ed E. Toletana Dapp-PG 735, due cosmsidistiche sono state costruite utilizzando il Cosmide Plauf3 (Stakawicz et al., 1987) come vettoriale. Gli inserti del DNA sono stati preparati mediante digestione parziale da Ecori dei due DNA genomici, quindi ciascuno è stato ligato nel sito corrispondente di Plaufr3. Il DNA della legatura è stato quindi imballato in X Phage Heads utilizzando l’estratto del pacchetto Gigapack III Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, California, Stati Uniti) e Phage Particles sono stati trasdotti in E. Coli HB101 come raccomandato dal fornitore. I due set di E. Coli HB101, ogni rifugi una biblioteca cosmossa, erano coniugati in massa nel biosensor AHL, C. Violoceum CVO26, come ricevitore. Ogni coniugazione ha portato a un transconcritto: il Cosmido PTH100 dalla Banca E. Toletana Cosmid Bank Dapp-PG 735 e il Cosmido PJD100 dal PSV DAPP-PG 722, che ha permesso il ceppo CVO26 di produrre violaceo e di diventare viola. Il sistema QS AHL di E. Toletana Dapp-PG 735 è stato chiamato ETOI / R ed è stato posizionato in un frammento hindiii da 8 Kb clonato in PBBRMCS-1, producendo PBBRTOLIR. Il sistema AHL QS di PSV DAPP-PG 722 è stato chiamato PSI / R ed è stato posizionato in un frammento NRU I 5800 PB, che è stato clonato a Pmosssir che produce pmosblue.

Domani mutanti zero-genomici hanno stato creato nel sistema AHL QS di PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans Dapp-PG 734 ed E. Toletana Dapp-PG 735 come segue. Per PSV (I), un frammento interno di 246 PC di PSSI è stato amplificato dal DNA genomico della tensione DAPP-PG 728 utilizzando il PSI per e PSI Rev (Tabella 1), e (ii) un frammento di 518 pb di PSSR è stato amplificato utilizzando i primer PSSR per e PSSR Rev (Tabella 1). Allo stesso modo, (i) un frammento interno di 387 PB di PAGI è stato amplificato dal DNA genomico dello sforzo DAPP-PG 734 utilizzando PAGI per e Pagi Rev (Tabella 1), progettato per assistenza. Geni pubblicati da PAGI / R di P. agglomerans. PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009), e (ii) un frammento di 561 PB di PAG è stato amplificato utilizzando PAG per e Pagr Rev (Tabella 1). Per E. Toletana (I), un frammento interno di 350 BP di TOLI è stato amplificato dal DNA genomico del DAPP-PG 735 che utilizza i primer Toli per e Toli Rev (Tabella 1) e ((ii) un frammento di 474 Pb of etor. amplificato utilizzando i primer Tolr per e Tolr Rev (Tabella 1). Tutti i prodotti PCR sopra menzionati sono stati clonati in PKNock-km digeriti utilizzando Eco RV, generando PKNock-PSI, PKNock-PSSR, PKNock-PAGI, PKNOCK-PUGR, PKNOCK-PAGI, PKNOCK-PAGR, PKNOCK-ETOI e PKNock-Etor (Tabella 1). Questi plasmidi sono stati quindi utilizzati come sistema di amministrazione suicida per creare mutanti di inattivazione del ceppo PSV DAPP-PG 722, P. Agglomerans Dapp-PG 734 ed E. Toletana DAPP-PG 735 per ricombinazione omologa come descritto in precedenza da Alexeyev (1999). Questi esperimenti hanno permesso la creazione dei seguenti mutanti genomici: DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 734PAGI, DAPP-PG 734PAG, DAPP-PG 734Pag, DAPPP-PG 735EO e DAPP-PG 735etor (Tabella 1). Tutti i mutanti sono stati verificati da PCR utilizzando primer specifici del vettore PKNock-Km e sequenze genomiche del DNA a monte ea valle dei geni mirati.

Estrazione, visualizzazione e quantificazione AHL

I ceppi di PSV, P.Gli agglomerani ed E. Toletana sono stati prima testati per la produzione AHL utilizzando un’analisi “T-Trail” su un supporto solido come descritto in precedenza da Piper et al. (1993), utilizzando Biosensori AHL (tutti rivisti da Steindler e Venturi, 2007). A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4), C. VIOACEUM CVO26, E. Coli MT102 (PJBA132), Pseudomonas F117 (PKRC12) e Pseudomonas F117 (PSC8) su Luria – Piatti Gellati Bertani.

Ahls sono stati purificato dal supernatante esausto e separato utilizzando una piastra di cromatografia sottile strato (ccm) per cromatografia in fase retromarcia su C18, come precedentemente descritto da Shaw et al. (1997). Per la visualizzazione su ccm, la piastra è stata ricoperta da uno strato sottile di alto top gellata con A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) in presenza di 100 μg ml- 1 di X-Gal come precedentemente descritto da Shaw et al. (1997) o con il Luria Superior Agar – Bertani ha seminato con C. Vicaceum CVO26 (McClean et al., 1997).

Rilevamento AHL e identificazione AHL mediante cromatografia di fase liquida ad alte prestazioni e MS

L’AHLS Prodotto da PSV, E. Toletana e P. Agglomerans sono stati identificati dalla spettrometria LC / MS / MS (MS) in un esperimento di monitoraggio multi-reazione come precedentemente descritto da Gould et al. (2006). La sorveglianza è stata effettuata sulla transizione dello ione genitore alle cime dei gruppi acilici e del lattone. Le cime sono state confrontate con gli standard noti e valutati anche dall’analisi del tempo di ritenzione cromatografico. Un volume di 200 ml di supernatant di cultura acellulare è stato estratto utilizzando lo stesso volume di etil acetato, dopo l’aggiunta di 0, 1% di acido acetico. Le fasi organiche sono state separate e essiccate sotto un cappuccio chimico. I campioni estratti per LC / MS / MS sono stati risospesi in 100 μl di acetonitrile, filtrati su un filtro di 0, 2 μm (Millex LCR4, Millipore, Billerica, MA, USA) e diluito a 300 μl con acqua milli contenente 0, 1 % trifluoroacetic acido. Un volume di 100 μl di questa soluzione è stato iniettato in un Gemelli C 18 di 2, 0 mm per 150 mm (fenomenex, Torrance, CA, USA) che operano ad una velocità di 200 μL min -1, dell’effluente. Che scorre direttamente nel spettrometro di massa. Il solvente è stato costituito da acqua contenente acido trifluororacetico dello 0,05% e solvente B incluso acetonitrile contenente acido 0, 05% trifluororacetico. La colonna è stata bilanciata nel 20% B per 15 minuti, il campione iniettato e la colonna è stata lavata per ulteriori 15 minuti. Un’elusione gradiente del 20% B al 95% B in 40 minuti è stata quindi utilizzata per la separazione di AHLS e la colonna è stata finalmente lavata al 95% B per 10 minuti prima di riequilibrare.

Test di motilità, Formazione Biofilm , Produzione EPS, IAA e Stelophores, Lipasi e Attività proteasi

Attività proteolitiche e lipolitiche, sciami e nuoto sono stati determinati come precedentemente indicato Huber et al. (2001). Il metodo utilizzato per rilevare le Stelophores è stato adattato dall’agar di Chromium-Azurol-S Agar Agar (Schwyn e Neiland, 1987) Agar Agar Dusing, precedentemente descritto da Caballero-Mellado et al. (2007). La produzione di IAA da batteri è stata misurata utilizzando un dosaggio a colori come descritto in precedenza da Gordon e Weber (1951) e Vasanthakumar e McManus (2004).

L’analisi della produzione di exotoploysAccaride (EPS) di P. Gli agglomerani ed E. Toletana sono stati testati su un re medio Kings (B) re, mentre PSV è stato testato su un mezzo di mannitolo solido minimo (mm) (0) (0), estratto 2% di lievito, 2% mannitolo, 1, 5 %). % agar). I ceppi batterici sono stati coltivati in scatole di Luria – Bertani, striata per dare alle singole colonie e cresciute a 28 ° C per 24 ore. Le colonie semplici sono state poi striate su KB o MM agar e coltivate per 48 ore a 28 ° C. Colonie che producono EPS hanno un aspetto mucoide fluido, mentre quelle con un carente EPS hanno una morfologia non muccata separata. E cremoso.

Esperimenti in Planta

Tutti gli esperimenti PLASTA sono stati eseguiti sugli ulivi (CV. Frantoio) invecchiato un anno. Per preparare gli inoculi, i batteri sono stati coltivati su na (agar dei nutrienti) a 28 ° C per 48 ore, sospeso in acqua sterile deionizzata e regolata da spettrofotometria a circa 2 x 10 8 cfu ml -1. Per inoculazioni, 10 μl della sospensione batterica contenente 10 CFU ML -1 o acqua (per gli impianti di controllo) sono stati collocati in ferite (da 3 a 5 per pianta) realizzati nella corteccia di oliva con un bisturo sterile descritto in precedenza da Moretti et al. (2008).Le ferite di impianti inoculari e testimoni sono stati protetti con parafilm m (American National Can, Chicago, IL, USA). Le piante sono state tenute in scatole in policarbonato trasparente per raggiungere un’elevata umidità relativa (90-100%) e mantenute in una camera di crescita a 22-24 ° C, con un’illuminazione da 70 μE M -2. -1 E un periodo di luce Di 12 h.

Nel primo esperimento di Planta, è stato controllato se il sistema PSV PSI / R AHL è stato coinvolto nella patogenicità e nella virulenza. PSV Parental Strisen DAPP-PG 722 e knock-out mutanti di PPSi e PPSR sono stati inoculati in ulivi e la gravità della malattia è stata valutata dopo 60 giorni misurando la profondità della proliferazione del tessuto utilizzando la proliferazione dei tessuti usando “una scena vernier.

Nel secondo esperimento, è stato valutato l’effetto della co-inoculazione degli ulivi con PSV o dei rispettivi mutanti di AHL QS e E. Toletana o P. Agglomerans, nonché i rispettivi mutanti di AHL QS, sulla gravità della malattia e della crescita batterica nelle piante. dopo l’inoculazione. Per la co-inoculazione, le due sospensioni batteriche sono state miscelate (rapporto 1: 1) per ottenere una concentrazione finale di 10 CFU ML -1. La gravità della malattia è stata registrata determinando il volume dei nodi, calcolati misurando la lunghezza, la larghezza e la profondità (sottraendo il diametro dell’asta misurata sopra il nodo di quello misurato sotto il nodo) del nodo a l Aiuta con un venerier (Moretti et al., 2008). Per la determinazione della crescita batterica, il tessuto corrispondente al sito di inoculazione è stato asportato e omogeneizzato dalla rottura meccanica. Le diluizioni seriali delle sospensioni batteriche risultanti sono state distribuite su piatti nale e incubate a 27 ± 1 ° C. I conteggi delle colonie sono stati eseguiti dopo 24 e 48 ore di incubazione. Le colonie di PSV si sono facilmente distinte da quelle di E. Toletana e P. Agglomerans. Le colonie della PSV, la cui crescita era più lenta di quella di E. Toletana e di Agglomerans, erano piccoli, bianchi, con un centro leggermente elevato e un bordo piatto e corrugato trasparente. Le colonie di E. Toletana erano non pigmentate, circolari, convessi, interi margini, fluidi traslucidi e molto mucidi (solo tipo selvaggio). Le colonie di P. Agglomerans erano gialle, circolari, leggermente convesse, con bordo irregolare, con superficie più o meno rugosa, fluido traslucido e molto mucoide (solo tipo selvaggio).

nella terza e quarta esperienza, L’effetto della co-inoculazione oliva con PSV ed E. Toletana sulla crescita batterica è stata valutata 3, 8, 15, 30 e 60 giorni dopo l’inoculazione (IPR), come descritto nella seconda esperienza. Tre impianti replicati per ogni livello di trattamento ((1) PSV, (2) E. Toletana, (3) PSV + E. Toletana) sono stati inclusi in ciascun esperimento. Per ogni impianto, gli inoculi sono stati collocati in tre ferite fatte in tre diverse posizioni: basal (circa 20 cm sopra il terreno), intermedio e apicale.

Analisi statistiche

I dati di Il primo e il secondo in esperimenti di Planta sono stati sottoposti a un’analisi delle variazioni e le medie sono state confrontate dal test di Duncan Multi-Beaches, utilizzando il software DSAASTAT V. 1.1 (ONOFRI, 2007).

I dati del terzo e del quarto negli esperimenti di Planta sono stati trasformati in logaritmi di base (per correggere l’eteroschedasticità) e sono stati utilizzati per impostare un modello misto lineare (Garrett et al. , 2004, ONOFRI, 2010) che descrive la relazione tra il numero di cellule batteriche e la radice quadrata del tempo (per ogni ceppo / gruppo) mediante funzioni polinomiali del secondo ordine. Le analisi preliminari hanno dimostrato che l’effetto della posizione di inoculazione (basale, intermedio e apicale) non era significativa e, pertanto, la posizione dell’impianto e l’inoculazione nell’impianto è stata aggiunta al modello come effetti casuali, al fine di tenere conto del gruppo dati. La stima dei parametri è stata effettuata dalla massima probabilità, come implementato nel pacchetto NLME nell’ambiente statistico R (Venables e Ripley, 2002). Le differenze tra ceppi / gruppi in termini di crescita cinetica sono stati valutati utilizzando test di probabilità.

Sequenziamento del DNA e numeri di accesso alla sequenza di nucleotidica

Tutte le sequenze di DNA sono state effettuate presso il Cribi Center (University di Padova, Italia) o Macrogen (www.macrogen.com) e le sequenze di nucleotidica sono state depositate in Genbank / EMBL / DDBJ. Il locus ETOI / R QS di E. Toletana DAPP-PG 735 è depositato sotto il numero di accesso FN870373, mentre il locus PSV PSI / R è depositato sotto il numero di accesso FN870374.

AHL Produzione e sistemi QS di ceppi P. Savastanoi, P. Agglomerans ed E. Toletana

In primo luogo, è stato interessante determinare se i residenti del PSV Patogeno e dell’oliva prodotta Molecole di segnalazione di AHL QS. Tutti i ceppi che abbiamo testato (Tabella 1) Producono composti AHL come inizialmente rilevati da test a forma di T su C. Vioaceum CV026 e A. Tumefaciens NTL4 (PZLR4) ed E. Coli MT102 (PJBA132), Biosensori. Per analisi CCM, inizialmente abbiamo attribuito il tipo di AHLS prodotto da PSV, P. Agglomerans ed E. Toletana (Figura 1 e Tabella 2). I risultati hanno mostrato che tutti i ceppi PSV e E. Toletana hanno prodotto due molecole AHL identificate provvisoriamente come C6-3-OXO-HSL e C8-3OXO-HSL (Figura 1). P. Agglomerans, d’altra parte, molto probabilmente ha prodotto la C4-HSL e C6-HSL. Per confermare inequivocabilmente gli AHLS prodotti dai tre coloranti, abbiamo utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa c 18 e la spettrometria di massa e sono stati in grado di verificare la produzione di 3-oxo-c6-HSL e 3 -oxo -C8. -HSL di PSV ed E. Toletana e C6-HSL e C4-HSL da P. Agglomerans (figura 1 aggiuntivo).

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PSV AHL Produzione Isolato dai nodi oliva e alloro-rosa, E. Toletana e P. Agglomerans. (a) CCM analizza gli standard sintetici AHL utilizzando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensore come livello di recupero. (b) Analisi TLC dell’AHL prodotta da sette ceppi PSV utilizzando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor come strato di recupero. Lanes: (1) ceppo LMG 2209 T; (2) Dapp-PG 536; (3) Dapp-PG 722; (4) Dapp-PG 723; (5) Dapp-PG 725; (6) Dapp-PG 726; (7) DAPP-PG 728. (c) Analisi CCM dell’AHL Prodotto da due ceppi di E. Toletana utilizzando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor come livello di recupero. LANES: (8) STEM CFBP 6631 T; (9) DAPP-PG 735. (D) Analisi TLC degli standard sintetici AHL utilizzando il Biosensor C. Vioaceum CV026 come livello di recupero. (e) Analisi CCM di AHLS prodotto da P. Agglomerans Dapp-PG 734 (Strip 1) utilizzando il Biosensor C. Vioaceum CV026 come livello di recupero. AHL, Lactone Acil Homoserine; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; CCM, cromatografia a strato sottile.

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Tabella a forma di dimensione intera

Il sistema AHL QS di PSV Dapp-PG 722 è stato identificato e clonato, come Spiegato in materiali e metodi, costituiti da un peer luxi chiamato PSI e un omologo di lusso denominato PSSR (Figura 2A). Il sistema PSI / R ha un alto grado di omologia (oltre il 90%) con il sistema AHLI / R AHL QS di P. Syringae, che risponde alla C6-3-OXO-HSL ed è coinvolta in virulenza (Quinones et al., 2005). Allo stesso modo, abbiamo identificato e clonato il sistema AHL QS di E. Toletana Dapp-PG 735 (vedere la sezione Materiale e Metodi) costituita da un etor designato LUXSI Peer designato (Figura 2A). Il sistema ETOI / R ha un’omologia significativa (circa il 60%) con il sistema Erwinia Chrysanthemi PV Expi / R. Zeae (= Dickeya Zeae), che non è solo responsabile della produzione di C6-3-OXO-HSL, ma anche della sua risposta (Nasser et al., 1998, Hussain et al., 2008). È stato stabilito da PCR, clonazione e sequenziamento del sistema AHL QS di P. Agglomerans del ceppo DAPP-PG 734 era l’ortologo (identità di oltre il 95%) relativa al sistema P. Agglomerans P. Aggglomerans PV. Gypsophilae (Chalupowicz et al., 2009).

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AHL Carte genetiche e produzione di mutanti Isolatori d’oliva Ahl QS-Knockout immerso su PSV, E. Toletana e P. Agglomerans. (A) Mappe genoliche di PPSi / R ed ETOI / R Clonate località di PSV ed E. Toletana, rispettivamente. Vedendo il sistema PPSSI / R, è dimostrato che i geni sono ortologi del gene PSV sequenziato NCPPB 3335. In effetti, la regione sequenziata qui nel ceppo DAPP-PG 722 è ortologo da quello nel ceppo NCPPB 3335. ((( B) (a) Analisi CCM di standard sintetici AHL utilizzando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor come livello di recupero. (b) Analisi CCM dell’AHLS prodotta da PSV PSV DAPP-PG 722 e derivati mutanti utilizzando A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor come strato di recupero. PSI – è dapp-pg 722SSII; PSSR – è il DAPP-PG 722PSI. (c) Analisi CCM di AHLS prodotta dal ceppo madre E. Toletana DAPP-PG 735 e derivati mutanti che utilizzano A. Tumefaciens PNTL4 Biosensor come livello di recupero. Toli- è dapp-pg 735toli; Tolr- è dapp-PG 735TOLR. (d) Analisi TLC di standard sintetici AHL utilizzando il Biosensore CV026 di C.Vioaceum come strato di recupero. (e) Analisi CCM di AHLS Prodotto dal ceppo madre di P. Agglomerans DAPP-PG 734 e derivati mutanti che utilizzano il Biosensor C. Vioaceum CV026 come livello di recupero. Pagi – è dapp-PG 734PAGI; Pagr – è il DAPP-PG 734PagR. AHL, Lactone Acil Homoserine; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, rilevamento del quorum; Savastanoi; CCM, cromatografia a strato sottile.

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I mutanti da knvout di PSV, P. Agglomerans ed E. Toletana sono stati generati sia nei geni QS Luxi – e nel Luxr – come descritto nella sezione materiale e metodi. Nessuno dei mutanti della famiglia Luxifero delle tre specie (Dapp-PG 722SSI, DAPP-PG 734PAGI e DAPP-PG 738Etoi; Tabella 1) ha prodotto livelli rilevabili di AHL quando è stato purificato dai supernatananti spesi (figura 2b). Questo risultato indica che le tre specie hanno probabilmente un solo sistema QS AHL; Per PSV, questa conclusione è corroborata dal fatto che solo una coppia della famiglia Luxi / R è presente nel suo genoma, che è stato recentemente sequenziato (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010). I mutanti della famiglia di Luxr, d’altra parte (DAPP-PG 722PSR, DAPPP-PG 734PagR e DAPP-PG 738Etor; Tabella 1) hanno prodotto quantità di AHL simili a quelle prodotte dal tipo selvaggio (figura 2b), questo che Indica in tre sistemi, non vi è stato alcun ciclo di amplificazione del segnale attraverso il regolamento genico della famiglia Luxi. Queste conclusioni si basano sull’analisi CCM di estratti supernatant esauriti da uguali quantità di cultura nella stessa fase di crescita. Questa è un’ottima indicazione, ma le misurazioni effettuate in tutta la fase di crescita confermerebbero probabilmente questa conclusione.

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qs in PSV regola la virulenza nelle piante

per esaminare Se il sistema PSV PSA / R AHL è stato coinvolto in patogenicità e virulenza, PSV PSV DAPP-PG 722 e mutanti knock-out derivati da PPSi e PSSR sono stati valutati e la gravità della malattia è stata valutata. Dopo 60 giorni. I risultati hanno chiaramente dimostrato che le mutazioni in PSI e PSSR hanno ridotto significativamente la dimensione dei nodi e quindi la virulenza dei mutanti (figura 3a). La profondità dei nodi è stata significativamente ridotta (p = 0, 01) nelle aste inoculate con i mutanti DAPP-PG 722SSIS e DAPP-PG 722PSRS relativi a quelli inoculati con il tipo selvaggio che mostrano rispettive riduzioni di circa l’80% e 88% (Figura 3b). ) Era importante, è stato pertanto concluso, per la nostra conoscenza, che era stata trovata che, per la prima volta, Ahl QS aveva giocato un ruolo centrale nella virulenza di PSV.

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Ruolo del ruolo DS AHL sulla formazione di nodi olivini indotti da PSV. (a) Gli steli degli ulivi di ulivi hanno invecchiato un anno (CV. Frantoio) sono stati inoculati con 108 mutanti derivati da CFU ML- 1 PSV DAPP-PG 722 (tipo selvaggio: WT), PSSI – e PSSR – e con impianti di controllo. I sintomi della malattia sono stati osservati 60 giorni dopo l’inoculazione. Grandi nodi elevati sono stati osservati nelle aste inoculabili con DAPP-PG 722 (tipo selvaggio). I mutanti del deficit in AHL QS PSI – e PSSR – hanno indotto solo una proliferazione cellulare limitata, che è rimasta limitata ai bordi della ferita. (b) La dimensione dei nodi è stata stimata misurando la profondità della proliferazione del tessuto in cinque impianti per ciascun trattamento e per tre nodi per pianta. Le differenze statisticamente significative nei nodi tra il tipo selvaggio e i mutanti QS sono stati determinati dall’analisi della variazione. Ogni valore è la media di cinque ripetizioni ± deviazione standard. Le medie non sono significativamente diverse (p = 0, 01) a seconda del test multiplo di Duncan. AHL, Lactone Acil Homoserine; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; QS, rilevamento del quorum; Savastanoi.

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PSV AHL SynThase Mutant può essere salvata dalla presenza di E. Toletana e in parte da P. Agglomerans

la presenza di E . Toletana e P. Gli agglomerani nei nodi dell’olivello potrebbero comportare la formazione di una comunità poli-microbica con il patogeno PSV. Dal momento che E. Toletana e P. agglomerans producono AHLS e che i mutanti PSV di AHL negativi hanno una virulenza molto bassa (vedi sopra), ciò consente una configurazione elegante di stabilire se i segnali di AHL siano condivisi e se le comunità interspecifiche sono formate nel Nodo Olivier. .

Come E. Toletana strutturalmente produce lo stesso AHL come PSV (vedi sopra), è stata inizialmente messa in atto una co-inoculazione in Planta. Il mutante PSI AHL SylThase è stato utilizzato per la co-infezione delle piante di ulivi con E. Toletana Damp-.Strareggio di tipo selvaggio PG 735. Questa co-inoculazione ha permesso al mutante PSV PPSi di indurre la formazione di nodi, nonché il ceppo di tipo selvaggio (figura 4). Ciò può essere probabilmente attribuito ai due ceppi che formano un consorzio, dove E. Toletana fornisce l’AHLS al DAPP-PG 722SSIS, che è quindi in grado di indurre l’espressione del gene bersaglio dell’AHL QS con conseguente formazione dei nodi D ‘Olive. Anche inoculazioni simili a coppie sono state effettuate anche con il tipo selvaggio DAPP-PG 734 di P. Agglomerans e, in questo caso, è stato osservato un ripristino parziale della formazione dei nodi (figura 4). Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che P. Agglomerans produce diversi AHLS di PSV, a cui il sistema PSI / R ha probabilmente risposto con meno efficienza. Importly, a coprile in ritardo delle piantane con l’E. Toletana o il P. Agglomerans AHL Syntase Mutante, Etoi Gold Pagi, respirabilmente, non ha ripristinato l’allenamento dell’oliva. Questo indici chiaramente che interspeciemente la comunicazione attraverso la condivisione di AHLS è stata fondamentale nei precedenti esperimenti di co-inoculazione in cui i mutanti di sintasi PSV AHL sono stati co-inoculati indipendentemente con i due ceppi di tipo selvaggio (figura 4).

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Effetto della co-inoculazione di impianti di ulivo (CV. Frantoio) con PSV ed E. Toletana, P. Agglomerans e i rispettivi mutanti AHL QS. PSV: Le colonne indicano l’effetto sulla gravità della malattia, espressa come volume del nodo (60 giorni dopo l’inoculazione), di inoculazione del PSV WT (colonne da tratteggio), di mutanti compromessa QS di PSV (colonne bianche rappresentano PSSR Mutants) solo oro in combinazione con P. Agglomerans (PAG) o E. Toletana (e) e relativi mutanti QS-dispari, Pagi, Pagr, Etoi ed etor. Le piante di controllo delle olive sono state inoculate con acqua di distilla (colonna grigia). Ogni valore è la media di cinque replicazioni ± il sesso seguita dalle stesse lettere non è statisticamente diversa a P = 0,05 (il test a raggio multiplo di Duncan). AHL, ACYL Homoserine Lactone; PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi; Qs, quorum sensing.

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Il PSV PSSR Mutant COUD non è completato per l’allenamento del nodo di oliva da parte di E. Toletana e P. Agglomerans; La ragione più probabile è che il mutante PSSR PSV non può rispondere a AHLS. Questi risultati indicano anche che E. Toletana e P. agglomerans i ceppi di tipo selvaggio non possono causare la malattia da sola in assenza di PSV di tipo selvaggio. Importy, in tutti gli esperimenti di co-inoculazione, gli importi comparabili delle unità di formatura della colonia PSV (CFU) erano presenti nel sito di inoculazione (figura 5).

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Effetto sui livelli di PSV di co-inoculazione di impianti di ulivi (CV. Frantoio) con PSV ed E. Toletana, P. Gli agglomerani e i rispettivi mutanti AHL QS. PSV: Le colonne nere indicano Effetto sulla crescita batterica in Planta (60 giorni dopo l’inoculazione) dell’inoculazione dei mutanti compromessa QS del PSV dello stesso batterio PSI (colonne bianche) PSSR dell’oro (colonne da schiusa) solo in combinazione con p . Agglomerans (PAG) o E. Toletana (e) e relativi mutanti QS-dispari, Pagi, Pagr, ETI e ETR. Ogni valore è la media di cinque replicazioni ± il sesso seguita dalle stesse lettere non è statisticamente diversa a P = 0,05 (il test a raggio multiplo di Duncan). PSV, Pseudomonas PV. Savastanoi.

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Si è conclusa che sia E. Toletana che P. Agglomerans possono formare le comunità stabili interspecie con PSV e che la comunicazione attraverso la condivisione dei segnali AHL stava avvenendo PLASTA.

Ruolo della segnalazione Interspecies e del consorzio a coppie in una malattia da nodo di oliva

Come evidente dai risultati sopra descritti, PSV forma comunità batteriche con E. Toletana e P. Agglomerans. Per cominciare a capire il ruolo e il risultato di potrie e le interazioni in possesso tra queste tre specie batteriche, la virulenza del PSV in presenza degli altri due batteri residenti di nodo di oliva è stata testata in Plata. Le piante di ulivi di un anno sono state inoculate per ogni sforzo batterico con 10 μL di un batterico con sospensione 10 8 CFU ML -1. Come mostrato nella figura 4, il miglioramento significativo della virulenza PSV in presenza di E. Toletana è stato osservato come indicato da un notevole aumento (quasi il 30%) del volume del nodo. Ciò ha indicato che E. Toletana contribuisce alla patogenicità del PSV; L’aumento della virulenza non è stato a causa dei cambiamenti nei livelli di PSV nella co-inoculante, poiché Materher era una differenza significativa nel carico batterico (figura 5). Lo stesso contributo alla virulenza PSV è stato osservato quando co-inoculante con la sintasi Mutante E. Toletana AHL; Non si può esclusiva, tuttavia, che i segnali PSV AHL sono percepiti da E. Toletana. Nessun aumento della virulenza, d’altra parte, è stato osservato quando P.Gli agglomerani sono stati co-inoculati con PSV, e in effetti una leggera diminuzione del volume del nodo era osservato. Quando co-inoculante con il p. Gli agglomerans AHL SylThase Mutant, tuttavia, è stato rilevato un aumento significativo della formazione del volume del nodo, il che significa che QS regola alcuni fattori in P. Agglomerans, che limita la crescita del PSV e / o l’espressione genica.

A seguito dei risultati ovvi sulla natura poli-batterica della malattia e sulla condivisione dei segnali AHL tra PSV e E. Toletana, è stato interessante capire meglio questa comunità batterica. L’impatto della co-inoculazione sulle dinamiche di crescita di questi batteri è stato determinato in due esperimenti distinti. Poiché i risultati di questi esperimenti sono simili, sono stati segnalati solo dati da uno degli esperimenti. La co-inoculazione è stata pertanto eseguita e le popolazioni batteriche sono state determinate fino a 60 dpi. Quando il PSV DAPP-PG 722 è stato inoculato da solo, un aumento di 10 volte potrebbe essere rilevato nella popolazione batterica isolata da 8 tessuti inoculati da 8 DPI (circa 10 7 cfu per sito) (figura 6a, cerchi vuoti). La popolazione PSV è aumentata gradualmente a circa 1, 5 × 10 8 cfu per sito a 60 dpi. Quando un’inoculazione mista con E. Toletana Dapp-PG 735 (figura 6a, cerchio completo) è stata eseguita, la crescita del PSV è stata notevolmente aumentata (test del rapporto di probabilità con P < 0 , 0001), mentre quando E. Toletana è stato inoculato da solo nella dimensione delle sue popolazioni (figura 6b, Triangolo aperto). D’altra parte, la crescita di E. Toletana non poteva essere adeguatamente descritta utilizzando un modello polinomiale di secondo ordine, ma è stato comunque stimolato significativamente a 30 dpi (l’errore di differenza standard era di 0, 018) in presenza di PSV (Figura 1). 6b, triangolo completo), e dopo 60 DPI, la dimensione della popolazione derivante dall’infezione mista era di circa 103 volte maggiore di quella ottenuta da semplici inoculazioni. Questi risultati sono un’ulteriore indicazione della relazione intima e reciproca tra PSV ed E. Toletana nel nodo di oliva, con conseguente aggravamento di sintomi della malattia, la condivisione dei segnali AHL QS e un aumento della crescita batterica.

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Le popolazioni di persone dinamiche di DAPP-PG 722 ed E. Toletana Dapp-PG 735 inoculati su steli di olive (CV. Frantoio), da solo o in combinazione. (a) Solo crescita PSV (linea continua e cerchio aperto) o in combinazione con E. Toletana (linea tratteggiata e cerchio riempito). (b) Crescita di E. Toletana da sola (linea completa e triangolo aperto) o in combinazione con PSV (triangolo punteggiato e completo). I simboli indicano i conti osservati e le linee indicano la regolazione del modello misto lineare. L’errore tipico di una media era 0, 013.

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Test di regolazione AHL-dipendente di diversi fenotipi a P. Savastanoi, p. Agglomerans ed E. Toletana

Al fine di stabilire il possibile ruolo dei sistemi AHL QS in batteri associati ai nodi di oliva, diversi fenotipi importanti sono stati testati per la regolazione dell’AHL QS nelle tre specie. Un elenco di tutti i fenotipi testati per il regolamento AHL QS è riassunto nella tabella 2. È interessante notare, abbiamo determinato che P. Agglomerans Dapp-PG 734 ed E. Toletana Dapp-PG 735 produce anche IAA. Abbiamo testato i tipi selvatici PSV (DAPP-PG 722), P. Agglomerans (DAPPP-PG 734), E. Toletana (DAPPP-PG 735) e i loro mutanti derivati (DAPP-PG 722PSI, DAPP-PG 722SSR, Dapp-PG 734PAGI, DAPPP-PG 734PAGR, DAPPP-PG 735ETO E DAPPP-PG 735ET) per la produzione di IAA. Allo stesso modo, abbiamo controllato se AHL QS è stato coinvolto nella produzione di Stelophores, la produzione di EPS, le attività proteolitiche e lipolitiche secrete e la motilità nuotando e sciami. I risultati di queste indagini sono riassunti nella Tabella 2. Sorprendentemente, nella maggior parte dei test, non sono state osservate differenze significative tra i ceppi dei motori e i loro derivati QS mutanti sotto le condizioni testate. La produzione di PES è stata testata qualitativamente in un test a piastre in tutti i ceppi selvatici e mutanti. I due mutanti AHL QS del ceppo PSV DAPP-PG 722 hanno mostrato una chiara riduzione della produzione di PES rispetto al tipo selvaggio (dati non presentati); La produzione di PES è stata ripristinata quando il mutante DAPP-PG 722PSI è stato coltivato in presenza di ESogeni C6-3-OXO o C8-3OXO-HSL (dati non presentati). Allo stesso modo, per P.Gli agglomerani, l’inattivazione di PAGI ha portato a una riduzione della produzione di PES; Tuttavia, nessuna riduzione è stata osservata nel mutante PARG rispetto al tipo selvaggio. La produzione di EPS è stata ripristinata quando il mutante DAPP-PG 734PAGI è stato coltivato in presenza di C4-HSL o C6-HSL (dati non presentati). La produzione di EPS è stata anche ridotta nel mutante E. Toletana Dapp-PG 735eto rispetto a quella del tipo selvaggio, e la complementazione dell’Aggiunta esogena C6-3-OXO-HSL o C8-3OXO-HSL ripristinata la produzione di EPS . Tuttavia, a E. Toletana, l’inattivazione dell’ETCH è aumentata considerevolmente la produzione di PES (dati non presentati).

Discussione

Ad oggi, molti studi hanno dimostrato che il batterico Le malattie delle piante derivano da interazioni complesse tra il patogeno e l’host. L’interazione del patogeno con la flora batterica residente è molto meno studiata e compresa. I batteri fitopatologenici formano comunità batteriche stabili con altri batteri residenti non patogeni? Queste reti di associazione sono all’origine di un’infezione multi-microbica? La segnalazione intercellulare ha un ruolo da svolgere nello stabilire questi consorzi batterici? Queste sono le domande che iniziano ad affrontare qui usando la comunità batterica presente nella malattia del nodo di oliva. Questa nicchia è creata dal PSV Patogeno; Tuttavia, molte altre specie batteriche residenti non patogeniche sono state isolate in questo ambiente, molto spesso E. Toletana (Rojas et al., 2004) e P. Agglomerans (Marchi et al., 2006). Le conclusioni principali di questo lavoro sono che (i) le tre specie isolate del nodo Olivier producono segnali AHL e hanno un sistema QS AHL; In particolare, E. Toletana e PSV producono lo stesso AHLS, (ii) AHL QS in PSV è essenziale per la virulenza perché i mutanti da knock-out sono fondamentalmente non virulenti, (iii) PSV I mutanti di AHL SynThase possono essere salvati da E. Toletana e In parte da P. Agglomerans, evidenziando la condivisione dei segnali AHL e la formazione di comunità batteriche stabili e (IV) E. Toletana formals comunità nella pianta, agendo come un patogeno associato in sinergia con il patogeno principale del PSV, aumentando le co-inoculazioni il numero di batteri di entrambe le specie e la gravità della malattia. Tutti i mutanti batterici costruiti in questo studio sono stati prodotti durante gli eventi omologhi di ricombinazione e coinvolgono anche inserimenti plasmidi. È quindi possibile che i nostri esperimenti svolti su piante senza la selezione di antibiotici portassero a un ritorno di mutanti al tipo selvaggio. Come tutte le esperienze di vigilanza del nostro studio non hanno portato al comportamento di tipo selvaggio, abbiamo concluso che non aveva avuto luogo alcun feedback significativo.

Attualmente, gli unici determinanti molecolari noti allo sviluppo dello sviluppo del nodo a PSV è il sistema di secrezione di tipo III (Sisto et al., 2004) e citochinina fitohormoni e IAA (Suico et al., 1985, vetro e Kosuge, 1988, Rodriguez-Moreno et al., 2008). Ahl QS può ora essere aggiunto a questo elenco e, a nostra conoscenza, è il primo sistema di regolamentazione collegato alla vilenza del PSV. Ahl QS probabilmente non influenzerà la colonizzazione iniziale, ma piuttosto l’espressione genica della virulenza associata a densità di alta popolazione. Sarebbe ora rilevante determinare se AHL QS è coinvolto nella regolazione dei tre determinanti della virulenza identificata alla data. Molto probabilmente, AHL QS regola anche molti altri fattori di virulenza. Il recente sequenziamento del genoma PSV ha evidenziato la presenza di molti loci che possono essere coinvolti in virulenza, tra cui cinque diversi sistemi di secrezione, gli effetti di tipo III, i composti fenolici, la chemiotassi, la motilità, l’adesione e i geni della tossina (Rodriguez-Palenzuela). et al., 2010). Abbiamo riferito che la produzione PES è regolata dal sistema PSV PSC / R; Tuttavia, non è chiaro se l’EPS sia coinvolto nel processo della malattia. La SPE, ad esempio, è un fattore di virulenza ed è regolato da AHL QS. È strettamente correlato a P. Syringae (Quinones et al., 2005).

La vita dei batteri all’interno del nodo è sconosciuta in senso lato. Uno studio recente, tuttavia, ha dimostrato che PSV crea il nodo formando aggregati batterici, microcolonia e biofilm multistrato (Rodriguez-Moreno et al., 2009, Perez-Martinez et al., 2010). Sappiamo poco degli effetti di P. Agglomerans ed E.Toletana sullo sviluppo dei nodi e la possibile formazione e stabilità del consorzio batterico multispecifico formato nel nodo di oliva. P. Gli agglomerani sono diffusi in molti habitat naturali e agricoli; In particolare, è associato a molte piante come Epiphyte e Embohyte (Lindow e Brandl, 2003). Inoltre, P. Gli agglomerani possono essere convertiti in uno specifico patogeno tumorigeno dell’host, un batterio commenso e un epiphyte associati a molte piante, acquisendo un’isola di patogenicità trasmessa da un plasmide (Barash e Manulis-Sasson, 2007).

L’AHLS prodotto da E. Toletana (C6-3-OXO-HSL e C8-3OXO-HSL) sono uguali a quelli prodotti da PSV. Questa è la prova che potrebbe esserci segnalazione interspecifica attraverso l’AHL tra le due specie quando occupano la stessa nicchia. P. Agglomerans, d’altra parte, produce C4-HSL e C6-HSL; Non possiamo escludere che PSSR e / o Etor siano in grado di rispondere a questi AHLS. Allo stesso modo, non sappiamo se il pav può anche rispondere ad AHLS prodotto da E. Toletana e PSV. I nostri studi che coinvolgono la coin inoculazione binaria a Plata hanno mostrato che E. Toletana può salvare i mutanti PSV PSI AHL sintasi per la loro capacità di indurre nodi olivi. Dal momento che i sintomi hanno messo almeno da 25 a 30 giorni per crescere, questo risultato suggerisce che. Toletana e PSV sono in grado di formare un consorzio stabile, dove le due specie subiscono una segnaletica interspecifica e una condivisione AHL. P. Gli agglomerans possono anche salvare, in parte, il mutante PSV PPSS; La ragione di questo salvataggio parziale è che l’AHLS prodotto da P. Agglomerans non è ben riconosciuto da PSSR, o che il consorzio non sia più stabile come per E. Toletana. È possibile che in questa nicchia, che consente un tale consorzio di crescere, per incoraggiare l’aspetto dei truffati batterici (ad esempio i ciechi imbroglioni del segnale, che non rispondono ai segnali AHL), che non contribuiscono a La Comunità può beneficiare di “fattori” o “beni pubblici” prodotti dai cooperatori QS (Diggle et al., 2007, Venturi et al., 2010). Molti altri isolati batterici dovrebbero essere isolati da questa nicchia per determinare questa possibilità.

La capacità di PSV di indurre la formazione dei nodi di ulivo si basa sulla sua capacità di regolare l’espressione dei geni in risposta. A Ambiente dell’ospite. Abbiamo anche iniziato a chiederci se la microflora avorementa aborigena contribuisca alla malattia causata dalla PSV. La co-inoculazione di E. Toletana con PSV ha portato a un aumento significativo del volume dei nodi di ulivo, indicando che questo consorzio è probabilmente molto stabile e che PSV beneficia della presenza di E. Toletana e forse anche del contrario. È anche importante notare che gli studi di co-inoculazione hanno determinato che E. Toletana e viceversa ha stimolato significativamente la crescita del PSV nel nodo di oliva, che indica una stretta associazione tra metabolismo, sostanze nutritive e segnale. Tra le due specie batteriche. Questo effetto sinergico di E. Toletana con P. Savastanoi indica chiaramente un vantaggio reciproco per entrambe le specie se crescono e condividono la stessa nicchia. La comprensione dei meccanismi di cooperazione e di comunicazione di questi due batteri illuminerà il processo di comunicazione interspecifica. E. Toletana non è patogenico quando è inoculato con il mutante PSSR di AHL QS PSV, ma può servire come agente patogeno quando è il consorzio con PSV di tipo selvaggio. È possibile che l’espressione dei geni PSV possa essere influenzata dalla presenza di residenti batterici o dal consorzio microbico stabilizza il PSV metabolicamente. La co-inoculazione di P. Agglomerans con PSV, d’altra parte, ha portato a una riduzione del volume del nodo, che è aumentato quando il co-inoculante era il Pagi del mutante Ahl Syntase. P. Gli agglomerani hanno maggiori probabilità di produrre e AHL QS regola il fattore, che influenza il PSV, e quando la produzione è ridotta, P. Agglomerans può anche fungere da patogeno accessorio.

C’è molto. Pochi rapporti Sul contributo / ruolo della flora microbica aborigena residente dell’host sull’azione di un patogeno in arrivo. È interessante notare che nel 1998 è stato riferito che nella rizosfera del grano, c’è un’interpretazione di specie batteriche che possono condividere le molecole da AHL (Pierson et al., 1998). Due studi recenti hanno dimostrato che la microflora indigena ha avuto un’influenza sulla virulenza di P. Aeruginosa e che colpisce anche i profili di espressione genetica dei fattori associati alla virulenza (Duan et al., 2003, sibley e al., 2008). .Attualmente non è chiaro se vi sia la condivisione del segnale tra questi batteri; È stato osservato che il segnale AI (Autoinucer) -2 produce sia i batteri gram positivi che i gram negativi negativi potrebbero essere un segnale interspecifico in questa Comunità (Duan et al., 2003, Sibley et al., 2008). È interessante notare che Dulla e Lindow (2009) hanno riferito di recente che i batteri epifili indigeni che producono lo stesso P. Syringae p. Le siringae possono eliminare e interferire con il processo causando la malattia. Questo lavoro ha evidenziato un cross-dialogo nella filosfera della pianta attraverso AHL, che ha portato a cambiamenti nel comportamento (principalmente motilità, che significa meno invasione) e, quindi, la virulenza di P. Syringae PV. Syringae. Il verificarsi della malattia durante la co-inoculante con i batteri epifili che producono AHL è stato ridotto del 50%. Si ritiene che ciò sia dovuto all’aduzione prematura e prematura di DS AHL che colpisce l’espressione dei fattori associati alla virulenza. Questo esempio mostra che anche la comunicazione interspecifica con la flora batterica indigena può anche avere conseguenze negative per gli agenti fitopatologeni.

I dati presentati qui rafforzano ulteriormente la complessità apparente delle infezioni policrobiali; I nostri risultati indicano un ruolo di condivisione di AHL e segnalazione interspecifica, che fornisce un eccellente modello di lavoro per approfondire le interazioni tra le comunità batteriche. Questo studio si concentra su interazioni mediate da AHL in habitat naturali; Fino ad ora, il ruolo di QS nei batteri associato alle piante è stato studiato quasi esclusivamente con ceppi unici, nonostante la possibilità di segnalazione interspecifica che può essere mediata dalla condivisione delle molecole di segnalazione AHL nelle comunità microbiche miscelate. Le interazioni tra i batteri dell’ambiente naturale sono complicate da una serie di fattori, compresa la risposta ospitante, i parametri ambientali e la specifica composizione della Comunità. Si suggerisce che gli studi futuri dovranno sviluppare sistemi in vitro per la comprensione pratica e dettagliata delle interazioni delle specie. Cominciamo a sviluppare strumenti per studiare le interazioni microbiche nell’ambiente naturale.

I nostri studi futuri si concentreranno sulla stabilità e sul ruolo svolto da ciascuna specie in questo consorzio microbico. PSV può essere considerato come il creatore di nicchia o il leader di questo consorzio, mentre P. Agglomerans ed E. Toletana sono occupanti o residenti di nicchia, che possono tuttavia diventare agenti patogeni ausiliari in presenza di una nicchia del produttore. Attualmente, non è chiaro se questi consorzi patogeni abbiano una ragione comune. Supponiamo che il Consorzio dei nodi di ulivi si sia evoluti di diventare stabile e cooperativa perché l’aumento della pool di geni e il repertorio metabolico combinato aumentano le possibilità di sopravvivenza dei partecipanti in varie condizioni (Venturi et al., 2010). Questo lavoro suggerisce che i processi di comunicazione complessi tra le specie potrebbero essere necessari per la formazione di tali consorzi.

Genbank / embl / ddbj

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